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  • 单细胞分析实录(12): 如何推断肿瘤细胞

    公众号后台回复20210418,获取本文的测试数据

    1. 回顾

    前面我已经讲解了inferCNV的基本用法,这一节继续学习:如何推断肿瘤细胞。本文应该是到目前为止,全网最详细的帖子(之一)。

    关于肿瘤细胞的推断,比如研究上皮细胞起源的肿瘤,我见过的一些做法如下

    1. 简单粗暴型:将来源肿瘤病灶的所有上皮细胞都看成是肿瘤细胞
    2. 看CNV:将来源于肿瘤病灶的上皮细胞和参考细胞比较,将那些有明显CNV的细胞看作肿瘤细胞
    3. 看表达特征:考虑到有的肿瘤细胞可能没有CNV层面的变化,有的文章会根据肿瘤与正常的表达谱来区分是否为肿瘤细胞

    如果你假设即使来源于病灶,也可能有正常(恶行程度很低)的上皮细胞,那么第2,3种做法就显得合理一些。实际数据处理中,我也确实看到过这种情况。这一节内容,我主要介绍第2种思路,第3种思路简单说一下。

    2. 看CNV

    既然是,那就要选择合适的图,来辅助你看。inferCNV跑完的结果会显示一张热图

    就比如这张图,相比于上方的参考panel,下方的观测panel可见一些明显的CNV,当然也可见一些细胞并没有明显的CNV,这些就是恶性程度很低的细胞。现在需要做的就是将这两种类型区分出来。

    2.1 方法一

    将参考和观测panel对应的矩阵提取出来,混在一起,聚类,之后每一个细胞会有一个类别label,挑出是肿瘤细胞的类别即可。为什么要混在一起呢?其实也是提供一个参考。聚成多少类,不需要特别精确,多于你肉眼能看出的类别数就行。不宜过多,操作起来麻烦;不宜过少,不然没有区分度。

    示例数据之前已经跑好了,代码在try1.R,inferCNV的结果保存在try1文件夹中,利用的是run.final.infercnv_obj文件,里面保存了最终画热图用到的表达矩阵,以及细胞注释。下面是代码,有点长,先上图

    library(infercnv)
    library(tidyverse)
    library(ComplexHeatmap)
    library(circlize)
    library("RColorBrewer")
    
    infercnv_obj = readRDS("./try1/run.final.infercnv_obj")
    expr <- infercnv_obj@expr.data
    normal_loc <- infercnv_obj@reference_grouped_cell_indices
    normal_loc <- normal_loc$normal
    test_loc <- infercnv_obj@observation_grouped_cell_indices
    test_loc <- test_loc$test
    
    anno.df=data.frame(
      CB=c(colnames(expr)[normal_loc],colnames(expr)[test_loc]),
      class=c(rep("normal",length(normal_loc)),rep("test",length(test_loc)))
    )
    head(anno.df)
    
    gn <- rownames(expr)
    geneFile <- read.table("EXAMPLE_ONLY_DONT_REUSE.txt",header = F,sep = "	",stringsAsFactors = F)
    rownames(geneFile)=geneFile$V1
    sub_geneFile <-  geneFile[intersect(gn,geneFile$V1),]
    expr=expr[intersect(gn,geneFile$V1),]
    head(sub_geneFile,4)
    expr[1:4,1:4]
    
    #聚类,7类,提取结果
    set.seed(20210418)
    kmeans.result <- kmeans(t(expr), 7)
    kmeans_df <- data.frame(kmeans_class=kmeans.result$cluster)
    kmeans_df$CB=rownames(kmeans_df)
    kmeans_df=kmeans_df%>%inner_join(anno.df,by="CB") #合并
    kmeans_df_s=arrange(kmeans_df,kmeans_class) #排序
    rownames(kmeans_df_s)=kmeans_df_s$CB
    kmeans_df_s$CB=NULL
    kmeans_df_s$kmeans_class=as.factor(kmeans_df_s$kmeans_class) #将kmeans_class转换为因子,作为热图的一个注释,最终在热图上就会按照1:7排序
    head(kmeans_df_s)
    
    #定义热图的注释,及配色
    top_anno <- HeatmapAnnotation(foo = anno_block(gp = gpar(fill = "NA",col="NA"), labels = 1:22,labels_gp = gpar(cex = 1.5)))
    color_v=RColorBrewer::brewer.pal(8, "Dark2")[1:7] #类别数
    names(color_v)=as.character(1:7)
    left_anno <- rowAnnotation(df = kmeans_df_s,col=list(class=c("test"="red","normal" = "blue"),kmeans_class=color_v))
    
    #下面是绘图
    pdf("try1.pdf",width = 15,height = 10)
    ht = Heatmap(t(expr)[rownames(kmeans_df_s),], #绘图数据的CB顺序和注释CB顺序保持一致
                    col = colorRamp2(c(0.4,1,1.6), c("#377EB8","#F0F0F0","#E41A1C")), #如果是10x的数据,这里的刻度会有所变化
                    cluster_rows = F,cluster_columns = F,show_column_names = F,show_row_names = F,
                    column_split = factor(sub_geneFile$V2, paste("chr",1:22,sep = "")), #这一步可以控制染色体顺序,即使你的基因排序文件顺序是错的
                    column_gap = unit(2, "mm"),
                    
                    heatmap_legend_param = list(title = "Modified expression",direction = "vertical",title_position = "leftcenter-rot",at=c(0.4,1,1.6),legend_height = unit(3, "cm")),
                    
                    top_annotation = top_anno,left_annotation = left_anno, #添加注释
                    row_title = NULL,column_title = NULL)
    draw(ht, heatmap_legend_side = "right")
    dev.off()
    
    #每一类对应的CB保存在kmeans_df_s数据框中
    write.table(kmeans_df_s, file = "kmeans_df_s.txt", quote = FALSE, sep = '	', row.names = T, col.names = T)
    

    这张图中,第1, 5类的细胞包含了normal以及少量的test,从图中看基本也是没啥CNV,所以将1,5剔除,剩下的5类定义为肿瘤细胞,对应的CB可以在kmeans_df_s.txt中获取。

    2.2 方法二

    除了上面这种纯看图的方法,有的文献还会对每个细胞的CNV水平做一个定量,我这里参考:Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma. 原文的CNV score是这么计算的"gene expression of cells was re-standardized and values were limited as −1 to 1. The CNV score of each cell was calculated as quadratic sum of CNV region"。

    原文献的图如下:

    我是这么理解的,将inferCNV的返回值做一些调整,使其背景值为0,然后再求每个细胞的所有基因CNV值的平方和。这里我觉得对inferCNV返回值矫正是不必要的(这些值已经是矫正过的),每个值减1之后求平方和就可以了。另外求和还不够,得除以基因数,因为每个矩阵inferCNV选用的基因数是不一样的,所以其实就是看方差,即每个细胞所有基因偏离背景的程度。

    我仍然以方法一中的7个类为例,计算它们的CNV level。

    expr2=expr-1
    expr2=expr2 ^ 2
    CNV_score=as.data.frame(colMeans(expr2))
    colnames(CNV_score)="CNV_score"
    CNV_score$CB=rownames(CNV_score)
    kmeans_df_s$CB=rownames(kmeans_df_s)
    CNV_score=CNV_score%>%inner_join(kmeans_df_s,by="CB")
    
    CNV_score%>%ggplot(aes(kmeans_class,CNV_score))+geom_violin(aes(fill=kmeans_class),color="NA")+
      scale_fill_manual(values = color_v)+
      theme_bw()
    ggsave("CNV level.pdf",width = 10,height = 6,units = "cm")
    

    可以看到,仍然是1,5两类值最低,且在0附近,加上这两类大部分是normal cell, 所以将他们划分为非恶性应该是没有问题的。

    网上有几篇关于计算CNV score的博客,如下,是将inferCNV的矩阵转换为0 1 2三种CNV程度,再在每个细胞中求和,这种思路和上面是一样的,但是我觉得实际操作起来不好做,主要是什么范围被划分为1还是2,不好说,不同的平台不同的数据集,数据范围有差异,比如我的10X数据最大1.3最小0.7,图片中的定义明显就不对。另外,这种方法在文献中没怎么看到(知道的读者可以回复一下)。

    3. 看表达特征

    这种方法,我看到的不多,主要参考2020年的一篇文章:Dissecting transcriptional heterogeneity in primary gastric adenocarcinoma by single cell RNA sequencing。

    在这篇胃癌的单细胞文献中,作者首先根据TCGA中的癌症和正常配对样本做差异分析,得到了两个初始signature,一个癌症样本高表达,一个正常样本高表达,各50个基因。

    • 用两个signature对每一个单细胞进行评分,可以得到一个cell_number x 2的矩阵
    • 接下来用k-means对所有的单细胞做聚类,只聚成两类,高表达癌症signature的定义为候选恶性细胞,高表达正常signature的定义为候选非恶性细胞
    • 继续对候选恶性、非恶性细胞做差异分析,得到两个新的signature,一类表达恶性,一类表示非恶性

    重复以上步骤,直到最终的两个signature的基因稳定。此处稳定的理解,我之前一直觉得是这一次的signature和上一次的signature相同,跑过几次代码之后,觉得这样理解太严格,绝大部分相同应该就可以。下面是原文献的图:

    这种方法之前用过,但对于我的数据集效果不是很好,反映在图上就是最终得不到文献图那么清晰的分界(见上图),一堆是恶性,一堆是非恶性,感兴趣的读者可以用这种方法试试自己的数据。下面的演示,我还是使用同上文一样的数据集,只不过从TCGA找初始signature这一步我省了,使用的是两个已经可以较好区分恶性、非恶性细胞的signature(比TCGA signature更接近最终signature)。
    主体代码如下,我只展示对于初始signature的操作,后续的迭代过程,代码类似,我就不展示了,有需要的朋友后台私信小编。

    library(Seurat)
    library(tidyverse)
    
    testdf=read.table("count_matrix.txt",header = T,row.names = 1,sep = "	")
    test.seu=CreateSeuratObject(counts = testdf)
    test.seu <- NormalizeData(test.seu, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)
    test.seu@meta.data$CB=rownames(test.seu@meta.data)
    test.seu@meta.data=test.seu@meta.data %>% inner_join(anno.df,by="CB") #anno.df有两列,一列CB,一列class表示细胞来源
    rownames(test.seu@meta.data)=test.seu@meta.data$CB
    
    TCGA=read.table("signature0.txt",header = T,sep = "	",stringsAsFactors = F) #通过TCGA得到的两个signature
    colnames(TCGA)=c("pathways","gene")
    for (i in unique(TCGA$pathways)) {
      TCGA_small=TCGA%>%filter(pathways==i)
      genes.for.scoring <- list(TCGA_small$gene)
      test.seu <- AddModuleScore(object = test.seu, features = genes.for.scoring, name = i) #AddModuleScore计算得分
    }
    
    metadf=test.seu@meta.data[,c("normal1","tumor1","class","CB")] #初始得分
    metadf%>%ggplot(aes(x=normal1,y=tumor1,color=class))+geom_point()
    ggsave("try_0.a.png")
    #在示例数据class列中,test表示肿瘤病灶取样,normal表示正常对照;在signature中,normal表示正常样本,tumor表示癌症样本
    
    #kmeans聚类
    kmeans.result <- kmeans(metadf[,1:2],2)
    kmeans_df <- data.frame(
      kmeans_class=kmeans.result$cluster
    )
    kmeans_df$CB=rownames(kmeans_df)
    metadf=merge(metadf,kmeans_df,by="CB")
    
    #kmeans为1 2分别代表什么细胞
    small1_metadf=metadf%>%filter(kmeans_class==1)
    small2_metadf=metadf%>%filter(kmeans_class==2)
    if( (mean(small1_metadf$tumor1) < mean(small2_metadf$tumor1)) & (mean(small1_metadf$normal1)>mean(small2_metadf$normal1)) ) {
      print("1:normal; 2:tumor")
      metadf$classification=ifelse(metadf$kmeans_class==1,"normal","tumor")
    }else if (mean(small1_metadf$tumor1) > mean(small2_metadf$tumor1) & mean(small1_metadf$normal1) < mean(small2_metadf$normal1)){
      print("1:tumor; 2:normal")
      metadf$classification=ifelse(metadf$kmeans_class==1,"tumor","normal")
    }else{
      print("error")
    }
    metadf%>%ggplot(aes(x=normal1,y=tumor1,color=classification))+geom_point()
    ggsave("try_0.b.png")
    
    metadf=metadf[,c("CB","classification")]
    colnames(metadf)[2]="classification_0"
    test.seu@meta.data=test.seu@meta.data%>%inner_join(metadf,by = "CB")
    rownames(test.seu@meta.data)=test.seu@meta.data$CB
    ###以上是针对初始signature的操作
    

    这里展示的图片说明这两次的结果很接近,且图形上看也比较好,所以没必要再继续迭代;反之,如果继续,可能会出现两堆细胞越来越混的情况(一步错,步步错)。就像下面这样,迭代20次之后,基本分不开了:


    这一篇的内容就到这里,下一期会写inferCNV在肿瘤细胞克隆进化方面的应用。

    因水平有限,有错误的地方,欢迎批评指正!

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