文献(4): Nature子刊_晚期非小细胞肺癌的单细胞图谱

今天介绍的这一篇文献[Ref1]，发表在NC上，中规中矩，分析内容很全面也很常见（话说，NC上面好多这种描述性的单细胞文章）。

下面我会简单介绍一下文献内容，涉及到以下内容，大家可能会感兴趣：

1. 这篇文章是如何鉴定肿瘤细胞的？（我之前专门写过一篇推文讲这个）
2. 肿瘤细胞和非肿瘤细胞一起降维聚类时，需不需要去批次？
3. 肿瘤细胞的异质性可以从哪几个角度说明？
4. 肿瘤细胞的拟时序/轨迹分析怎么做？
5. monocle2的经典图怎么看？
6. 细胞通讯分析怎么做？有哪些经典的受配体对？

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1. 背景

我们从标题中大概能知道这篇文献的主要工作是集中在晚期NSCLC的肿瘤异质性、肿瘤微环境。去年的统计数据显示肺癌已经是我国发生率和死亡率最高的癌症。
大家做单细胞的原因很多时候都是为了解决异质性的问题，为什么用药之后有的人有效而有的人没效，为什么刚开始有效过段时间又没效，这其中根本的原因就在于异质性，肿瘤细胞本身有异质性，周围的微环境也有异质性。最终的愿景是希望在完全了解透这些异质性后，能给患者分组，每一组给予特定的治疗方案。

2. 实验设计和初步结果

这张图显示了这篇研究的样本组成，有肺腺癌 肺鳞癌，有三期 四期，他们是否吸烟，有无致癌突变。这个图的展示形式还挺清晰的。

左上图展示了鉴定出来的11种主要的细胞类型，需要注意的是，这里面把Cancer和Epithelial、Alveolar是区分开的，也就是说肿瘤取样也可能含有正常的上皮细胞。这篇文章里面鉴定肿瘤细胞，方法非常简单，首先得是上皮细胞(高表达EPCAM)，然后不表达肺部组织正常上皮细胞的marker。比我之前讲的方法简单多了，准确性如何呢，我持保留意见，不过下文的CNV热图我们可以看到有一些病人所有肿瘤细胞是几乎没有CNV的。
左下图是病人来源信息，从图中可以看出，这张图是没有去批次效应的。原因有两个：一是对于非肿瘤细胞的亚群，不同病人聚类比较好，二是在这张图中，不想抹掉肿瘤细胞的肿瘤间异质性。这是原文的解释，我也很赞同，所以当你遇到肿瘤细胞、非肿瘤细胞一起聚类的情况，可以不去批次。非肿瘤细胞单独拿出来聚类就另说了。
右边两张图就比较常规了，marker基因热图（之前总结过展示marker基因的几种图，第一篇、第二篇），细胞亚群占比。

3. 解析肿瘤异质性

3.1 肿瘤间异质性

a图是根据腺癌、鳞癌，有无突变分组后，比较CNV（前面写过三篇inferCNV相关的帖子，学完可以画出更好看的CNV热图）。作者发现肺腺癌在chromosome 7 and 8q有扩增，在chromosome 10有缺失；肺鳞癌在3q有扩增，在5q有缺失。该结论并不是在所有病人中都成立。
b图c图一起看，C图是说这些肿瘤细胞可以聚成20类，b图说的是每一个病人中，每个cluster的占比。从b图可以看出在多数的肺腺癌中（图的右边1/3的样本）会聚到一起（很像），并且每个病人中只有一个主要的cluster；而肺鳞癌病人之间没有那么像，并且好几个病人有多个cluster。这说明肺鳞癌有更高的肿瘤间异质性，以及更高的克隆性。
这一部分是肿瘤间异质性：腺癌鳞癌之间，病人之间。

3.2 肿瘤内异质性

为了定量肿瘤内部的异质性(ITH)，作者定义了两个ITH分数，一个基于表达矩阵得到ITH_GEX，一个基于inferCNV输出的矩阵得到ITH_CNA。在矩阵中，所有细胞两两之间算一个相关系数，对于这些数值的分布，0.75分位数减去0.25分位数就得到这个分数。左图显示这两个ITH分数有一定的相关性，但不强，因为CNV虽然可以影响基因表达，但基因表达还受很多其他因素的调控，比如TF、小RNA、点突变、与周围环境的细胞互作等等。
右图比较了不同分组之间的ITH分数。

4. 正常上皮细胞到肿瘤细胞的轨迹分析

关于肿瘤细胞的拟时序，我见过正常上皮细胞和肿瘤细胞放在一块来分析的，几乎没有见过肿瘤细胞单独做拟时序，而且我也觉得这样做没什么道理，我觉得肿瘤细胞不同状态是一种优胜劣汰的关系，不同状态之间是否会相互转变感觉不是很明确（我没说EMT, CSC这种线性的转变），所以即使做了拟时序结果也不一定可靠。

• 如果正常上皮细胞之间的发育轨迹已经清楚，将其作为参考，和肿瘤细胞一起做轨迹分析，可以知道正常上皮细胞发育的哪些阶段更容易发展成肿瘤细胞（其实这种情况，从表达谱相似性也能看出来，之所以还要这么做，可能是因为大家觉得轨迹分析看上去高大上一些），比如Ref2中的Fig. 2b；
• 如果正常上皮细胞（多种）向肿瘤细胞进展的关系已经清楚，通过做轨迹分析，可以完善已知路径，明确几种正常上皮细胞是如何发展成肿瘤细胞的，可能是独立的，也可能存在中间状态；也可以同上面一样，看看别的上皮细胞是否也容易发展成肿瘤细胞。

这篇文章是第二种情况，以图中肺鳞癌为例。已知basal cells和club cells可以发展成LUSC肿瘤细胞，做完monocle2发现club cells处在更末端的位置，basal cells处在靠近club cells的枝干上，肿瘤细胞分布在其余位置，因此可以将已知的路径改写成：basal cells似乎是club cells向肿瘤细胞转变的中间状态（原文似乎这个词用得太好了，没把话说绝，也省了实验验证，我学废了）。

5. Th17和Treg潜在的转变

文章说这是首次在肺癌中找到Th17细胞亚群，并揭示了Th17和Treg潜在的转变关系（之前已经被报道过）。
d图是用Slingshot做的，颜色深浅表示拟时序的先后，Th17和Treg之间被连起来，说明存在转换关系。
右边的分支图和热图是monocle2画的，之前刚学monocle2的时候，比较疑惑的是热图里面的fate1和fate2分别表示什么，这张图就说得很清楚了。从你想研究的节点（图中的1节点）到根（一般是人为指定，图中是CD4 naive对应的状态）都是pre-branch，然后沿着拟时序的方向（跟你指定的根状态有关），右边的枝是fate1（对应图中的增殖细胞），左边的枝是fate2（对应Treg细胞）。热图里面选了一些pre-branch、fate1、fate2对应细胞的差异基因来呈现，从热图中间向两边看，能看到不同的fate表达不同的基因。文中说，从图中可以看出Th17是沿着naive到Treg的中间状态。
结合这两种方法，得出Th17和Treg有潜在的转变关系。

6. TME中的免疫细胞组成

在解析了肿瘤细胞、重要免疫细胞之后，作者又看了每个病人中细胞亚群的占比，并探究了哪些因素能影响细胞占比。

a图是说，不同的分组影响中性粒细胞的占比，文章是将中性粒细胞作为一种免疫抑制的亚群来说的。
d图是说，随着异质性分数的增加，几种免疫抑制的亚群占比增加，浆细胞亚群占比减少。（浆细胞分泌抗体对肿瘤细胞有一定的杀伤作用，可以通过介导NK细胞，或是激活补体系统等途径，不过抗肿瘤免疫平时说得比较多的还是T细胞杀伤这种细胞免疫方式。）
因此作者得出结论，认为ITH升高，会增加免疫抑制微环境，降低肿瘤杀伤能力。

7. 细胞通讯分析

文章的最后一部分讲的是细胞通讯，虽然作者说不同的分组有不同的细胞间通讯网络，但从文中给的图来看，几组都整体差不多，有个别差异。
如果用过cellphoneDB，会发现输出结果里面有统计学意义的受配体对很多很多，之前比较两组的受配体对，试过肉眼比较两张大热图一个一个看，太花时间了，后来就干脆提前整理好想要比较的受配体对（文章里面经常出现的受配体对就那些），直接从输出文件里面提取，省事很多。
比如，我图中圈出来的几个，

1. 趋化因子及其受体，说明肿瘤细胞会招募中性粒细胞这种免疫抑制的亚群；
2. VEGFA相关的受配体，说明肿瘤细胞会促进血管生成（内皮细胞），保证自身营养供应；
3. Treg表达CTLA4分子，巨噬细胞（作为抗原提呈细胞APC）表达CD86，二者结合，那么能给CD8提供抗原的APC就少了，从而减少CD8的激活；
4. 耗竭性CD8 T细胞表达CTLA4是一个特征，与APC表达的CD86结合后，启动抑制性信号。

8. 总结

最后总结一下，我觉得的这篇文章的亮点：

• 填补了晚期非小细胞肺癌单细胞转录组领域的空白
• 文章第一次在NSCLC中发现了Th17，并揭示了Th17和Treg的潜在转变关系
• 从多个角度解析了肿瘤的异质性（肿瘤间、肿瘤内都做了分析）
• ITH与免疫抑制微环境的关系

9. Ref

1. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer
2. Lee, H. O., et al. (2020). "Lineage-dependent gene expression programs influence the immune landscape of colorectal cancer." Nat Genet 52(6): 594-603.

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OK啦，这篇文献就说到这里，欢迎三连哈~

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