前言
植物基因组大小跨越几个数量级，倍性和杂合性变化，以及新旧基因组转座子变化等带来组装挑战。三代和物理图谱提供了新机会，单倍型定相、结构变异分析、从头泛基因组研究成为新兴组装热点。
植物基因组发展：
- 拟南芥：sanger BAC-by-BAC。
- shotgun OLC （CELERA assembler）：木瓜、大豆、杨树等早期测序植物。
- 454/Illumina DBG 短序列高深度带来植物基因组组装大爆发，但质量较低。
- 单分子PacBio长度长带来接近完整染色体组装。
- 辅助技术发展：Hi-C/BioNano（无需昂贵的BAC物理图谱）
- ONT纳米孔能达上Mb，组装拟南芥、番茄、高粱、香蕉、甘蓝等更连续和完整的版本。
在过去20年种，有400多个植物基因组已发表，包括333个被子植物，15个非被子植物、2个轮藻和44个绿藻。
可查阅：
https://www.plabipd.de/portal/web/guest/sequenced-plant-genomes
1. 单分子长度长测序
PacBio通过CCS产生HiFi 15 kb reads的方法准确率高达99.8％，解决了错误率问题，但每条read成本高了近5倍。
基因组测序的发展，在基因组完整度上已经有了很大提升。
2. 长度长基因组组装的错误倾向
新算法的设计目的：correct, overlap, and polish long reads with high error-rates。
算法随计算设计、速度、内存使用、复杂基因组利用而变化。
- 自纠方法self-correction：CANU、Falcon（phase/unzip）、MARVEL、MECAT。利用reads相互比对，需要较高覆盖度。
- correction-free：基于OLC的minimap2/miniasm、基于DBG的wtdbg2和Flye。要求更高复杂度的基因组。
组装的草图有误差，必须用高覆盖度的长读长或短读长polish，一般大于三次可达到>99.6%的准确性。
- long reads：Quiver/Arrow (PacBio)、Medaka (ONT)、Nanopolish、Racon。
- short reads：Pilon
PacBio CCS HiFi软件：Peregrine
3. 物理图谱技术
- a.Hi-C
- b.Optical maps
4. 解决复杂植物基因组
如下图，两条染色体组装时定相，杂合基因组phasing有如下方法：
- 右上：嵌合假分子，简化下游分析。
- 右中：原始reads比对到contigs，解决缺失的单倍型区域，建立一个定相的二倍体组装。
- 右下：保留部分单倍型，并在基于图的组装中加以标记。
5. 利用组装图
组装经典指标是N50，或者最短序列长度大于组装的50%，方法过于简单。
利用组装图可以可视化复杂度和邻接contig的overlap。
- 纯合简单基因组（左上图）：理想的graph对于每个contig（节点）只有一条边和邻接序列相连。
- 气泡图（左下图）：高杂合性，节点（单倍型）被多条边连接。
- 复杂重复（右上图）：在图结构中较模糊，如rRNA,centromeric satellite DNA。
- 毛团（hairballs，右下图）：多拷贝重复，无清晰路径，节点互交。
当参考基因组被泛基因组取代时，基因组图论将是代表复杂基因组更好的方法。
挑战和展望
挑战：
- 多倍体和杂合度
展望：
- 基因组完整、少gap、定相。
- denovo替代重测序，挖掘更多多样性，用于群体遗传和泛基因组分析。
- 基因组注释将落后于组装，提高注释质量需要新技术（如全长cDNA，PacBio Iso-seq等）以及新算法。
参考文献：Todd PMichael. Building near-complete plant genomes. Curr Opin Plant Biol. 2020 Apr;54:26-33.