ATAC-seq数据处理流程 | 自定义 & 个性化分析

本文的分析套路剑指10-20分的journal，全是干货。

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发现一个不错的专题，讲得很详细。

ATAC-seq/ChIP-seq分析方法

其中一个细节IDR，讲得很通俗。

第6篇：重复样本的处理——IDR

ATAC-seq data analysis: from FASTQ to peaks

基本概念：

• ATAC-seq和ChIP-seq鉴定出来的peak到底是一些什么区域？除了promotoer就是enhancer
• TSS enrichment和motif是两个不同的套路，TSS是特指启动区域，每个基因只有一个；另一个就是motif，这就是抓出TF，哪些TF在发挥作用

分析套路

鉴定差异peak

• 两组数据比较
• 多组数据比较 - peak cluster

处理细节：

• Peak calling was performed using MACS2 from all sample reads. 多样本这样处理更加靠谱，macs2出来的peak结果才是靠谱的，不要随便用bedtools修改源头的peak，否则得到的peak很奇怪

• The number of raw reads mapped to each peak at each condition was quantified using the intersectBed function in BedTools. 最终用的别人推荐的multicov

• Raw counts in peaks were normalized using the DESeq package in R.

• Peak intensity was defined as the log2 of the normalized counts.

bedtools multicov -bams 1.bam 2.bam 3.bam 4.bam-bed file.bed > read.count.txt

可视化差异peak

• peak signal heatmap
• distance to TSS

ngsplot这个工具比较好用，很直观，有bam就可以用，不像其他工具，一大堆复杂的衍生格式，没有搞的欲望。

ngs.plot.r -G hg19 -R tss -C example.bam/hesc.H3k4me3.1M.bam -O hesc.H3k4me3.tss -T H3K4me3 -L 3000 -FL 300

Make Enriched Heatmaps

• 已经测试通了，用ngsplot来快速画图，生成数据；然后用EnrichedHeatmap来画最终的图。
• 改一下color set，能够画出媲美下面的美图了。

peak功能注释

• GO terms enriched in peak clusters
• 可选工具一：Y叔的ChIPseeker，教程
• 可选工具二：GREAT网络工具，教程

peak邻近基因表达分析

• expression level of genes closest to the top 1000 peaks

• 可以画二维散点图来展示ATAC-seq和RNA-seq的关系，理想情况是显著正相关关系。

motif富集分析

• TF motifs enriched in peak clusters
• 结合转录组基因表达数据验证
• 如何直接在ggplot里添加motif images，教程
• 可以直接用meme-chip一步到位

export PATH=/home/lizhixin/softwares/ATAC-seq-conda/anaconda3/bin:$PATH

sortBed -g genome.txt -i up.sig.peak.bed > sorted.up.sig.peak.bed
sortBed -g genome.txt -i down.sig.peak.bed > sorted.down.sig.peak.bed

cut -f1-3 sorted.up.sig.peak.bed > sorted.up.sig.peak.3col.bed
cut -f1-3 sorted.down.sig.peak.bed > sorted.down.sig.peak.3col.bed

bedtools getfasta -fi /home/lizhixin/softwares/miniconda3/share/homer-4.10-0/.//data/genomes/hg38///genome.fa -bed sorted.up.sig.peak.3col.bed -fo sorted.up.sig.peak.3col.fasta

bedtools getfasta -fi /home/lizhixin/softwares/miniconda3/share/homer-4.10-0/.//data/genomes/hg38///genome.fa -bed sorted.down.sig.peak.3col.bed -fo sorted.down.sig.peak.3col.fasta

intersectBed -a /home/lizhixin/project2/analysis/ATAC-seq/encode-pipeline/ipsc/result/atac/c3097359-919e-43d3-9b81-551e4c8ff029/call-filter/shard-0/execution/glob-3bcbe4e7489c90f75e0523ac6f3a9385/IMR90-iPS_1.trim.merged.nodup.no_chrM_MT.bam -b sorted.up.sig.peak.3col.bed > tmp.bam
samtools index tmp.bam
ngs.plot.r -G hg19 -R tss -C tmp.bam -O IMR90-iPS_1.tss -T IMR90-iPS_1 -L 3000 -FL 300

　　

motif印迹分析

• ATAC-seq footprint for specific motifs
• rgt-hint这个工具可以做，教程
• 搞明白什么是 TF footprint，看这篇文章：Identification of transcription factor binding sites using ATAC-seq

转录因子网络

• Cis-regulatory networks of TFs

ChIP-seq数据验证ATAC-seq结果

个别基因可视化问题 - bigwig

• UCSC genome browser看signal，都是导出pdf，自己再编辑
• IGV
• 测序数据可视化 （三） - UCSC genome browser

重点文献：

• From reads to insight: a hitchhiker’s guide to ATAC-seq data analysis
• Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids