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教材 Molecular biology of the gene 7th edition J.D. Watson et. al
翻译
翻译机器的组成
- mRNA
- tRNA
- aminoacyl tRNA synthetase
- ribosome
一、信使RNA
1、多肽链是由可读框决定的
- 含有多个ORF的mRNA叫多顺反子
- 只有1个ORF的mRNA叫单顺反子
2、原核细胞mRNA具有核糖体结合位点，可以募集翻译机器
- 核糖体结合位点（RBS）
- 一般位于 密码子5'端 3~9bp内
- 与核糖体 16S rRNA 的 3'端互补（5' CCUCCU 3'）
- 某些原核细胞ORF缺乏RBS也能翻译，是因为ORF紧接着上一个ORF：翻译耦合translational coupling
3、真核细胞mRNA在5' 和 3' 被修饰，促进翻译
- 真核mRNA的 5'帽是甲基化鸟嘌呤核苷酸
- 可以募集核糖体结合
- 核糖体向下游扫描，寻找AUG
- 在某些mRNA中，起始密码子周围有些保守位点
- 5'- G/ANNAUGG-3' Kozak序列：与起始tRNA互作
- 3' poly-A 尾： 增强5'Cap 的募集作用
- 帽和尾 稳定RNA
二、转运RNA
1、tRNA是密码子与氨基酸之间的转配器
特征
- 3'端均为5'-CCA-3' ：氨基酸结合位点
- 存在特殊碱基：
- ΨU 假尿嘧啶
- D 双氢尿嘧啶
- H 次黄嘌呤
- T胸腺嘧啶
- Gm 甲基鸟嘌呤
2、共有三叶草二级结构
- 受体臂
- ΨU loop
- D loop
- anticodon loop
- variable loop
3、tRNA具有L形三维结构
三、氨基酸连接到tRNA上
1、氨基酸通过高能酰基连接到tRNA 3'端腺苷酸上使tRNA负载
- 腺苷酰基化 adenylylation（ATP）
- tRNA负载
2、每种氨酰-tRNA合成酶连接一种氨基酸到一种或多种tRNA上
每个氨基酸对应一种合成酶
- 特殊的合成方式：Glu合成到tRNAGln，Glu在氧化成Gln
3、tRNA合成酶识别位于同族（cognate）tRNA上独特结构特征
- 受体臂上鉴别者碱基
- 反密码子环
4、保证氨酰-tRNA合成的精确
- 酶口袋的尺寸阻止大氨基酸进入
- 酶中的编辑口袋水解尺寸过小的氨基酸
- 那么只有正确的氨基酸能合成
5、核糖体不能辨别tRNA的负载是否正确
6、硒代半胱氨酸
- 存在于谷胱甘肽过氧化物酶，甲酸盐脱氢酶
- 由UGA终止密码合成：特殊地机制
四、核糖体
- DNA复制速度 200~100bp/s
- 转录速度 50~100bp/s
- 翻译 原核 20AA/s 真核 2~4AA/s
1、核糖体由一个大亚基，一个小亚基组成
- 大亚基：肽基转移酶中心 peptidyl transferase center
- 小亚基：解码中心 decoding center
- 大小亚基按照沉降速录命名（不和质量成严格正比）
2、核糖体循环
- 合成方向 N->C
- 形成肽键的过程：将正在延伸的多肽转移到另一个tRNA上
- 肽键的形成不需NTP水解：氨酰-tRNA储存着能量
3、核糖体RNA是核糖体中结构和催化功能决定因子
- 以RNA为中心
4、核糖体有3个tRNA结合位点
- A 氨酰tRNA结合
- P 肽酰tRNA结合
- E tRNA离开位点
5、核糖体内的通道使mRNA与延伸多肽进出
五、翻译的起始
- 核糖体募集
- 负载tRNA置于核糖体P位点
- 核糖体精确定位
1、原核细胞
- 三种起始因子指导 mRNA 和 tRNA 装配起始复合物
- IF1 结合到A位点，防止起始tRNA结合
- IF2 GTP酶，促进起始fMet-tRNAifMet结合至P位点，阻止别的结合
- IF3 与小亚基结合，阻止翻译起始前大亚基结合（最后结合）
- 随着起始因子的加入，小亚基准备好和mRNA，tRNA以任意顺序结合
- 与mRNA结合：RBS 与 16S RNA相互作用
- 结合后，起始密码子正好处于P位点
- 起始 fMet-tRNAifMet 的结合：通过GTP与IF2相互作用
- 起始的Met被加上甲酰基（Met-tRNA转甲酰酶） ：f-N -> C
- 起始密码子与起始tRNA配对：小亚基构象变化，IF3释放
- 大亚基结合（IF2作为初始对接位点），形成70S 起始复合体
- IF2、IF1 释放
- 许多蛋白质不是以Met开始的，氨肽酶通常会在氨基酸切除Met及另外一两个氨基酸
2、真核细胞
- 真核细胞中tRNA结合先于mRNA的结合
- 使用另一组辅助因子
- 核糖体小亚基结合上mRNA 的 5'Cap，扫描AUG（ATP)
- 扫描到AUG后，组装大亚基，开始翻译
- 翻译起始因子使真核mRNA保持环状：提高翻译效率
六、翻译的延伸
- 氨酰-tRNA结合上A位点：EF-Tu-GTP辅助
- 延伸：肽酰转移酶将多肽链加到A位点负载tRNA上
- 易位
- 在两种延伸因子的辅助下，正确的阅读ORF
氨酰tRNA结合
1、氨酰-tRNA由延伸因子EF-Tu送达A位点
- EF-Tu-GTP覆盖tRNA3'端的氨基酸：防止过早反应
- 正确匹配结合上A位点后，大亚基的某结构域激活GTP水解
- EF-Tu-GDP释放
2、核糖体利用多种机制排斥错误配对的 氨酰-tRNA
- 小亚基 16S RNA的两个碱基识别 tRNA-mRNA 之间的小沟：错配小沟形状不符合
- EF-Tu-GTP=tRNA复合物要处于正确位点，才能导致GTP水解
- 易位时，错误配对的tRNA容易脱落
肽键的形成
3、核糖体是一种核酶
- rRNA处于活性中心，蛋白起辅助作用
- 熵催化 entropic catalysis
- rRNA通过碱基配对，将底物稳定在活性中心已促进反应
- 底物辅助催化
- P 位点 tRNA 的 2'OH 通过质子穿梭机制辅助催化
易位
4、肽键的形成启动大亚基中的易位反应
- 大亚基的易位先于小亚基
5、EF-G推动易位
- EF-G-GTP结合在大亚基上
- EF-G-GTP水解形成EF-G-GDP 构象改变，占据A位点
- 推动小亚基中的易位
- 多米诺骨牌似的使得P位的tRNA易位向E
- 稀有移码tRNA（4bp）补偿移码错误
EF-G-GTP 的 分子拟态：
- EF-G-GTP 的形态很像 EF-Tu-GTP=tRNA复合物
6、EF-Tu-GDP 和 EF-G-GDP 在新一轮延伸前，要将GDP换成GTP
- EF-Ts促进 GDP与 EF-Tu解离
- EF-G 与 GDP亲和力<GTP亲和力，直接换
7、形成肽键的一个循环消耗两个GTP，一个ATP
- 氨酰-tRNA的形成 1ATP
- EF-G-GTP 牵引氨酰tRNA正确匹配 1GTP
- EF-G-GDP推动易位 1GTP
翻译的延伸中，原核与真核很相似
EF-Tu ：eEF1
EF-G ：eEF2
七、翻译的终止
1、释放因子在终止密码子的作用下终止翻译
- 核糖体循环在 终止密码子进入 A 位点后，就停止
- 终止密码子被释放因子识别 release factor
- 两类释放因子
- I 类释放因子识别终止密码子：RF1 、RF2
- II 类释放因子：释放肽链后，刺激 I 类因子从核糖体解离
2、I 类因子的一小段区域识别终止密码子，并催化多肽链的释放
- I 类释放因子上的肽反密码子识别终止密码子
- I 类释放因子的GGQ序列促进了多肽链的释放
- I 类释放因子功能上模仿了tRNA
3、II 类释放因子的功能受GTP、GDP调控
4、核糖体循环因子模仿tRNA
- 核糖体循环因子（RRF）识别结合A位点
- EF-G-GTP结合核糖体，GTP水解，占据A位点，促使RRF易位至P
- 两个tRNA脱落
- IF3 加入 EF-G-GDP脱落
八、翻译的调控
- 翻译主要在起始阶段调控
1、蛋白质或RNA在RBS附近结合负调控细菌翻译的起始
- RNA分子的配对会被核糖体打破，后续的核糖体可以识别
2、原核翻译调控：核糖体蛋白是其自身结合翻译的抑制因子
- 原核核糖体蛋白基因的协同调控通过若干操纵子得以简化
- 核糖体蛋白翻译的自我抑制：
- rRNA充足时，核糖体蛋白首先结合rRNA
- rRNA缺乏，核糖体蛋白结合自己的mRNA RBS附近
- 阻止翻译
3、真核翻译总体调节因子以mRNA识别及起始tRNA结合所需关键因子作为靶标
- mTor因子对4E-BP的磷酸化与翻译的调控
- 磷酸化的4E-BP不能结合5'Cap，翻译进行
- 这是化疗药物的靶点 雷帕霉素
4、对mRNA特异的4E-BP进行翻译空间的调控
- 果蝇卵母细胞护送Oskar mRNA从前向后运输
5、铁离子调控转铁蛋白翻译
6、酵母转录激活因子Gcn4 的翻译受到上游短ORF及三元复合物丰度的调控
- Gcn基因上游4个小的可读框
- 翻译完第一个可读框的核糖体剩下一个小亚基在mRNA上
- 氨基酸充足，因素介导，小亚基迅速结合三元复合物，寻找下一个ORF起始密码
- 氨基酸缺乏时，小亚基结合三元复合物变慢，小亚基移出小ORF区后，才结合上，识别下游Gcn4基因起始密码，翻译
多聚核糖体谱
- 被核糖体结合多的就是翻译活跃的
九、依赖翻译的mRNA和蛋白质稳定性调节
- mRNA会出错，但在翻译中被识别出来之前，它是稳定的
1、原核生物
- 缺乏终止密码子
- 核糖体在3'末端停滞，A位空缺
- SsrA RNA 加入A位点
- 类似正常的转肽和易位反应，将前面的tRNA和mRNA踢出
- SsrA RNA加入后翻译出来的多肽带有10个氨基酸的标签，招募蛋白将其降解
2、真核生物
① 无意义密码子介导的mRNA衰减
- 真核生物mRNA经过剪接后，会留有 外显子拼接复合物
- 正常的翻译，核糖体会将一路上的 拼接复合物清除
- 如果提前终止了，就有 拼接复合物无法清除
- 招募5'->3'、3'->5'外切酶清除mRNA
② 无终止密码子介导衰减
- 真核mRNA以poly-A结尾
- 无终止密码子，会翻译出尾端的多个 AAA（赖氨酸）
- 招募降解mRNA 和 蛋白质
③ 末端终止介导的衰减 no-go decay
- 当核糖体因为二级结构，或者相关tRNA不够用时，停滞，招募降解
十、遗传密码
1、遗传密码的简并性
- 密码子第一位改动改变氨基酸
- 第二位：嘧啶往往疏水；嘌呤往往极性
- 第三位：较少会发生氨基酸的改变
2、遗传密码的摆动性
|
反密码子 |
密码子 |
|
G |
U 、C |
|
C |
G |
|
A |
U |
|
U |
A、G |
|
I |
A、U、C |
3、遗传密码遵循3条规律
- 5'->3' 阅读
- 密码子不重叠，信息间不重叠
- 固定可读框上翻译
4、突变与抑制突变
- 错义突变
- 终止突变
- 移码突变
- 一个碱基缺失导致移码突变：可以由随后增加一个碱基的突变补偿
- 因为突变产生的提早的终止子可以被特殊的tRNA抢先读取，
5、遗传密码几乎通用