RNA -seq

RNA -seq

RNA-seq目的、用处：：可以帮助我们了解，各种比较条件下，所有基因的表达情况的差异。

比如：正常组织和肿瘤组织的之间的差异；检测药物治疗前后，基因表达的差异；检测发育过程中，不同的发育阶段，不同的组织之间的基因表达差异 等

在所有检测的差异类型中，最常用的一种检测就是：检测所有mRNA的表达量的差异。

还可以检测 RNA 的结构上的差异。例如：mRNA的剪接方式的差异，即“可变剪接”；还可以检测“融合基因”，同时还可以检测基因单点突变导致的SNP。

测序方法、步骤：人的细胞或组织，一般抽提到的总RNA当中，95%都是核糖体RNA。剩下的2%到3%是mRNA。还有2%到3%是Long non-coding RNA、或者tRNA、microRNA等

先把核糖体RNA先去掉。然后再进行建库测序。比如利用Poly(A)尾巴 抓出mRNA ，镁离子溶液打断，逆转录成cDNA ，再建库扩增，测序

表达量指标：目前最常用的是RPKM值，对基因表达量进行相对定量的一个指标。RPKM是 Reads Per Kilobase of exon model perMillion mapped reads。

除以这个外显子的长度，它的目的：是修正这个mRNA长度所引起的mRNA的Read数的偏差。

火山图：针对全转录组的分析，表达的是一次看到一个整体的样本（表达）差异的情况。

横轴表示某个基因的表达量是上升或下降。纵轴是表示这种差异的置信程度。这其中的每个点，就是两个样本当中同一个基因的mRNA表达量的变化。

聚类分析图：它是通过多个样本的全基因表达谱对比，来找到它们之间的相似性，和相近关系。

一张聚类分析的图，横轴是样本，纵轴是基因。

应用：我们可以分析疾病的亚型；还可以通过对多个基因在特定疾病当中的表达倾向性，来找出可能的、新的、诊断用的Biomark。

GO(gene ontology)分析：

GO主要描述基因的三个属性： 

第一，是这个基因，它参与的生物过程 

第二，是这个基因产物的功能 

第三、是这个基因产物在细胞器内的空间定位

差异基因GO富集柱状图：可以直观的反映出在生物过程、细胞组分、和分子功能富集的差异基因的个数分布情况。 柱子越高，则表示这个亚类当中突变越多。

有向无环图，是差异基因GO富集分析的图形化展示方式，从上到下，它所定义的功能范围越来越小、越来越精准。 它的分支，表示包含关系。而这个圈圈的颜色越深呐，表示这个富集关系程度越高。

通路(Pathway)分析：在系统水平上完成生物的某一功能的基本单元、或者局部子网络。

散点图是KEGG富集分析结果的图形化展示方式。 

在图中，KEGG富集程度通 Rich factor、Qvalue 和 富集到此通路上的基因个数 来衡量。 

富集因子越大，则表示富集的程度越大。 qValue是校正之后的pValue，它越接近于0表示富集程度越显著。点面积越大呐，则富集的基因数越多。

RNA-seq中，可以测到mRNA上的各种结构上的变异，即RNA序列的变异。要求测序深度要更深。因为这样才能得到较完整的覆盖，更有把握判断 新的剪接点、一个断点、哪儿碱基发生了突变等。

结构变异分析：

可变剪接：一般一个人的组织样本当中，可以通过高通量测序，发现有5000个到20000个左右的可变剪接。

基因融合：融合基因的示意图，圆形 圆内弧线连接图

点突变(SNP)：泡泡图，泡泡越大 突变频率越高，由大到小逆时针排列