从16世纪末开始，，科学家们就一直使用光学显微镜探索复杂的微观生物世界。然而，传统的光学显微由于光学衍射极限的限制，横向分辨率止步于 200 nm左右，轴向分辨率止步于500 nm，无法对更小的生物分子和结构进行观察。突破光学衍射极限，一直是科学家们梦想和追求的目标。
虽然随着扫描电镜、扫描隧道显微镜及原子力显微镜等技术的出现，实现纳米级的分辨率已经成为可能，但是以上这些技术存在对样品破坏性较大，只能观测表面等缺点，并不适合生物样品，特别是活体样品的观测。近十几年来，一系列适合生物样品成像的超分辨成像技术应运而生，包括结构光照明（SIM），受激发射损耗荧光显微技术（STED），光激活定位显微技术（PALM），随机光学重建显微技术（STORM）等等。在接下来几期前沿显微成像技术专题中，我们将为大家做详细介绍。
光学分辨率极限
光以波的形式传播，当一个点光源通过透镜在成像面聚焦为一个小光点时，不管物镜有多好，成像光点都会比实际的发光点大。这是因为光波在物镜光阑的边缘会发生衍射，将波前向外扩散（图1）。
图1 发射荧光在物镜孔径边缘发生衍射
衍射光斑有一个明亮的中心点，以及环绕它的一系列亮度渐弱的衍射环，称为艾里斑。当两个点过于靠近，所成的像斑重叠在一起，就分辨不出是两个点的像了。因此，光学分辨率存在一个极限。根据瑞利判据，当一个艾里斑的中心与另一个艾里斑的第一级暗环重合时，刚好能分辨出是两个点所成的像（图2）。用公式表示如下：
d = 1.22λ / 2NA
d表示分辨率，λ是发射光的波长，NA是物镜数值孔径。
图2 光学分辨率极限示意
以GFP为例，λ=510nm，采用NA=1.4的物镜，光学分辨率的极限就是222nm。但是在生物系统中，膜蛋白，转运蛋白和核糖体等亚细胞结构往往小于50 nm，而且通常不会间隔足够远。这样一来，就不可能直接对其进行清晰的成像。
怎么办呢？科学研究的脚步当然不可能止步于此。为了克服衍射极限，研究人员开发了一系列超分辨成像方法。在本期中，我们将首先为大家介绍单分子定位超分辨显微成像技术~
这种超分辨显微技术都是通过选择性地打开和关闭单个荧光基团，确保成像区每次仅有少量、随机、离散的单个荧光分子发光，再通过高斯拟合，定位单个荧光分子(点扩散函数)的中心位置（图3），以实现高精度的空间定位，最后将系列图片叠加合成一幅超分辨图像。
图3 通过高斯拟合进行定位
不同的技术所使用的“开关”荧光的方法不同，下面我们就来看看它们各自的原理和特点吧~
光激活定位显微技术（PALM）
PALM (Photoactivated Localization Microscopy)由Eric Betzig和Harald Hess于2006年首次发表于《Science》。它的原理其实非常简单，一句话概括就是通过“开关”与目标分子结合的光激活荧光蛋白，对其进行分批定位，确定中心光斑的位置。
光激活荧光蛋白PA-GFP是绿色荧光蛋白的变种，可以被适当波长（405nm）的激发光激活。实验时首先随机激活一部分荧光蛋白，再用488nm激发荧光，就可以只采集一部分目标分子的荧光信号。荧光蛋白被激活的概率与激发光的强度成正比，只要激活的蛋白足够少，相距足够远，就可以对其进行定位。完成数据采集后，对这些荧光蛋白进行光漂白直至完全失活，然后再激活另一些荧光蛋白进行定位。重复这个过程，就可以将样品中的所有目标分子定位，将这些原始数据合并，就能得到目标分子的超分辨图像。
Betzig等人在文章中将PALM与全内反射荧光显微镜（TIRF）进行了比较（图4）。可以看到PALM对于荧光分子的定位精度远高于TIRF。
图4 TIRF（A）和PALM（B）对溶酶体膜的成像效果比较（Betzig et al., 2006）
随机光学重建显微技术（STORM）
STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) 由华人科学家庄小威等人同样于2006年发表于《Science》杂志。它的基本原理与PALM类似，不同的是STORM使用合成的光转换荧光染料，而不是光激活荧光蛋白与目标分子结合。那么它是如何控制荧光的开关的呢？
荧光染料被激发进入发射态，之后会进入暗态（Dark state），在暗态中它们将与自由氧结合，进入漂白状态。在漂白状态下，染料不会再次发出荧光。如果不让染料与自由氧结合，它将无法进入漂白状态，一直维持在暗态。高功率的激发光可以使染料从暗态再次进入发射态。这种从亮到暗再到亮的状态切换看起来就像是染料在“闪烁”一样。
和PALM一样，STORM也是通过随机的分批“点亮”目标分子来进行超分辨定位（图5）。由于消除了光漂白步骤，STORM可以更快地采集数据。不过，STORM高度依赖于荧光染料的特性：既需要产生足够强的信号，同时又要有良好的闪烁密度。如果染料闪烁得太快，相邻的分子之间可能会有很多干扰，无法定位单个分子；但是如果它们闪烁得太慢，可能无法获得足够的图像来定位每个分子。STORM最初使用的染料是cy3和cy5，不过目前最流行的是Alexafluor 647。
图5 哺乳动物细胞微管和CCP的双色STORM成像（Bates et al., 2007）
DNA-PAINT
DNA-PAINT (DNA-Based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography) 是一种比PALM和STORM更新的技术，由Ralf Jungmann等人于2014年发表。它的原理是利用DNA链的互补性产生类似于荧光分子闪烁的效果。
在DNA-PAINT中，双螺旋DNA链的其中一条与目标分子相连，作为“对接”链，另一条被荧光标记，作为“成像”链。由于DNA链彼此之间是高度特异性结合的，因此成像链和对接链在溶液中会自发结合，在焦平面上产生单分子荧光。通过调整成像链的结合强度和浓度，可以反复产生瞬时结合，获得类似STORM中荧光染料的最佳闪烁速率。对获得的数据进行重建，就可以得到最终的超分辨率图像（图6）。
除了可调控的结合速率外，DNA-PAINT的另一个显著优点是任何荧光染料都可以用于成像 链，便于进行多色成像。
图6 DNA-PAINT获得的Hela细胞微管 (绿色) 和线粒体 (洋红色) 的双色超分辨率图像（e）和相同区域的衍射极限图像（f）效果对比（Jungmann et.al., 2014）
PALM，STORM等单分子定位超分辨显微成像技术自诞生以来，被广泛的应用到了各种研究领域，极大地增强了定位亚细胞结构与探索它们之间相互关系的能力。譬如对局部粘着复合物及其分布进行纳米尺度的成像，细胞骨架中细微结构的成像等。