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  • |chromosomal walk |zoo blot|鉴定疾病gene|

    5.6基于外显子的保守性鉴定真核生物编码蛋白质的基因

    鉴定功能性基因的流程是:1.连锁分析找到该基因的染色体的特定区域;2.在这段序列中选择一条短序列,寻找满足两个条件的基因(条件一:因为功能性基因是可以编码出蛋白质的基因,所以它必须有可读框;条件二:因为功能性基因是保守的,所以它必须是种间同源的。);3.使用zoo blot(动物基因组印记杂交),将待测序列作为探针,与种属基因组中的生物基因进行杂交,能够互补的探针即作为外显子候选片段。4.对该片段进行测序,确定是否有可读框5.若有可读框,就能在外显子中定位出该基因(gene mapping)。现在该流程已封装在基因芯片中。最后可在全基因组中找到该基因的同源序列。

    随着人类基因组计划完成,可以通过高分辨率的SNP和基因组序列图找到患病基因。

    所以,现在的流程是:

    1.连锁分析(分析家系)2.染色体步查chromosomal walk (每个个体,RELP,限制图,然后mapping,找到该基因以及该基因的缺失)3.zoo blot(因为exon的保守性) 4.cDNA杂交(因为cDNAmRNA反转录得到,所以可以得到mRNA情况(因为mRNA中只有外显子),所以进而得到外显子和内含子情况)

    因为有时出现基因缺失,为了明确正常基因的exon,所以采用外显子捕获(exon trapping)技术,捕获目标基因。

    首先将找到符合(exon-intron-exon)结构的突变基因A转染细菌已达到扩增的目的,采用符合(intron-exon-intron)结构的基因组片段B,因为把酶切位点定在BAintron上,所以B放入exon两端可以被自动识别,此时进行PCR时发现扩增序列中含有此exon(因为此时完整序列中已含有该exon),则达到捕获的目的。

     

    目前,可以使用mRNA大规模测序然后mapping得到exon鉴定。

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