生物信息学-基因表达分析
为了丰富中心法则，研究人员使用不断更新的技术研究lncRNA的方方面面，其中技术主要是生物学上的微阵列芯片技术和表达数据分析方法，方方面面是指lncRNA的位置特征。
Background：根据中心法则，发现DNA与RNA与protein之间的关系，此时认为找到的RNA全部用于编码protein，但是实验结果中：非编码RNA含量高，而coding区只占很少的一部分。研究非编码RNA，发现noncoding与protein expression有关，所以总思路变成了研究noncoding区从而丰富中心法则，而研究noncoding区的前提是转录组分析。
转录组研究
1.依据实际研究的问题，可以有不同的思路
时间（生长发育不同阶段）特异性
空间（身体不同区域）特异性
Normal 与否
- 随着测序技术的发展，出现了以下RNA的测序手段
SAGE：将RNA反转录得到的cDNA打碎，利用sanger测序法得到最后的序列
DNA微阵列： 将RNA打碎，用基于reference的探针（特指基因芯片）测得序列，此方法灵敏性高
RNA-seq：将RNA打碎，再将片段RNA反转录cDNA，利用二代测序（short reads）assembly而成。
Long noncoding RNA
定义：
1.因为200bp，所以long；
2.因为No protein produce但同时有与coding gene具有相似结构（都有intro和exon），所以lncRNA长期被认为是假基因，直到发现其和转录调控有关系，才开始被重视。
起源：
- coding gene mutation变成noncoding gene，所以无法coding protein
- Chromosome重组
- sncRNA加倍成为lncRNA
- sncRNA插入coding gene使之丧失功能但长度变长，成为lncRNA
分类：基于与protein的位置
lncRNA发现历史：
在大规模测序出现之前，只能利用sanger发现单个lncRNA。在完成human genome 之后，基于该数据库，得到的芯片，大大加速了lncRNA的发现。随着二代测序的大规模使用，大量发现结构，因此诞生了基于不同算法的assembly&annotation软件（eg，scripture、tophat、cufflinks）。所以，如今的思路是利用不同工具处理相同数据，将得到的不同结果集成为更准确的genome，从而得到比较可靠的reference。（review：Rinn and Chang，2012）但是2015用更多的原始数据用同样方法重做，发现其中有79%之前没有的，这是因为原始数据采集更在时间和空间上更为细致了。如今，得到了NONCODE （数量最多dataset）、MITranscript （最新）等各有侧重的数据库。
Assembly比对方式：
1.交叉--保留
2,存在不交叉的，利用其它参数信息（eg，位置信息）筛选
Gene expression 分析：
原则：重复&随机&间隔
Replication：biology（eg，同一个gene测100次得到100个sequence信息） &technical（对于100个sequence信息，可以随机抽取其中的任意N个，这种抽取做M次），这都是为了数据能更好的反应客观事实。
Randomization：无论是抽选或是物理设备参数设定，都要保证随机性。
Blocking：生物学实验的连贯性（物理条件一致，eg，一天一个完整实验，而不是一天所有完整实验中的一个步骤）
以微阵列方法为例的流程：
在仪器上得到荧光信号，将这些应该信号按照光的亮度赋值，由图转变为表，该表就是表达谱。根据荧光信号的特点，比如中间较强周围较弱就比较好，进行质量控制，也就是筛选质量较好的sample。此时，所有gene的表达量都在一个表格里面，其中使用三张芯片就被叫做生物学重复，以此创造：
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|
芯片1 |
芯片2 |
芯片3 |
|
Gene1 |
2 |
4 |
4 |
|
Gene2 |
5 |
4 |
14 |
|
Gene3 |
4 |
6 |
8 |
可知芯片1比芯片3的光照程度整体普遍弱，这可能是由于物理因素造成的。为了进行比较，要将其数值进行归一化（normalization），依据比价对象的不同，可将方法分为两种：
- Intra：eg，芯片1内部比较不同gene表达量（技术是双通道的MA，归一化方法是LOWESS ）
- Inter：eg，gene1在不同芯片上的表达量，（技术是单通道；思路可以是中位数归一化或qualitile归一化图
其中，qualitile归一化 的过程是：
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芯片1 |
芯片2 |
芯片3 |
|
Gene1 |
2 |
4 |
4 |
|
Gene2 |
5 |
4 |
14 |
|
Gene3 |
4 |
6 |
8 |
不看属于哪个gene，在芯片内部进行排序：
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|
芯片1 |
芯片2 |
芯片3 |
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Mean=10/3 |
2（Gene1） |
4（Gene1） |
4（Gene1） |
|
Mean=16/3 |
4（Gene3） |
4（Gene2） |
8（Gene3） |
|
Mean=25/3 |
5（Gene2） |
6（Gene3） |
14（Gene2） |
求均值并写回去，这样做是为了避免物理错误，物理错误会导致整张芯片的效果都不好。不用考虑排序会因为表达量一致而造成误差，因为实际上不存在表达量完全一致的情况：
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芯片1 |
芯片2 |
芯片3 |
|
Gene1 |
10/3 |
10/3 |
10/3 |
|
Gene2 |
25/3 |
16/3 |
25/3 |
|
Gene3 |
16/3 |
25/3 |
16/3 |
归一化之后，利用假设检验证明实际问题。
当数据服从某种分布（既有参数）时，可就某些参数（eg，mean）进行假设检验
当数据未知分布（即无参数），则采用permutation test：
使用的理论是t检验中的SAM，因为t-test需要有参数，但是现在数据未知参数，所以加入置换测试的方法
SAM"Statistical Analysis of Microarrays" specifically designed for microarray data analysis. It relies on the non-parametric permutation test. SAM is a variant of the t-test. Shown below is an excerpt of Tushner's paper describing the SAM algorithm:
Eg，分为测试组（treatment）和对照组（control）：下图是它们的数据分布D
|
Key |
T1 |
T2 |
T3 |
C1 |
C2 |
C3 |
|
Gene1 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
将其随机打乱成1000个类似于下方表格的sample：
比如其中的2个是：
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Key |
T1 |
T2 |
T3 |
C1 |
C2 |
C3 |
Mean of T |
Mean of C |
STDEV of all |
|
Gene1 |
6 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
3 |
4 |
1.870828693 |
|
Key |
T1 |
T2 |
T3 |
C1 |
C2 |
C3 |
Mean of T |
Mean of C |
STDEV of all |
|
Gene1 |
5 |
1 |
2 |
3 |
4 |
6 |
2.666666667 |
4.333333333 |
1.870828693 |
其中，S0是给定值，d可以认为是改良版的t值，如此得到1000个t值，这1000个t值可构成正态分布统计图表，最后根据总体分布，找到数据分布D的p值，而后根据该p值判断假设检验的结果。
由此，可以得到所有基因对应的p值，但是因为p值的错误率很高，所以需要采用多重假设检验对p值做检查。
可采用FDR
首先对于每个基因来说，都有p值，p值的含义是false positive rate(FPR，假正率)：q值是false discovery rate (FDR)：
因为未知真实情况，但是从上图可知真实情况和估算情况之间的关系，所以可以使用别的方法计算FWER和FDR。
Control of FWER：
The Bonferroni procedure
Tukey's procedure
Holm's step-down procedure
Control of FDR
Benjamini–Hochberg procedure
Benjamini–Hochberg–Yekutieli procedure
例如，BH：
,
，所以q-value的期望即是FDR，所以，求出每个gene的q-value即可
原先每个gene都有自己的p值：
可靠gene的p值满足：
可靠gene的q值满足：
其中，k是gene number号，a是自己设定的0.05，m是所有gene个数,在这里是6；
把gene按照p值排序并据公式处理，得到：
若写为函数表达则可得到上图，有四个gene的p值是可靠的。