微生物群落多样性测序与功能分析
1.几个概念：16S rDNA（或16S rRNA）；OTU；测序区段。
1.3测序区段：由于16S rDNA较长（1.5kb），我们只能对其中经常变化的区域也就是可变区进行测序。16S rDNA包含有9个可变区，分别是v1-v9。一般我们对v3-v4双可变区域进行扩增和测序，也有对v1-v3区进行扩增测序。
2.工具/原料：
2.1样本：16S rDNA测序首先需要提取环境样品的DNA，这些DNA可以来自土壤、粪便、空气或水体等任何来源。
2.2提取DNA：提取DNA后需要经过质检和纯化，一般16S rDNA测序扩增对DNA的总量要求并不高，总量大于100ng，浓度大于10ng/ul一般都可以满足要求。如果是来自和寄主共生的环境如昆虫的肠道微生物，提取时可能包括了寄主本身的大量DNA，对DNA的总量要求会提高。微生物菌群多样性测序受DNA提取和扩增影响很大，不同的扩增区段和扩增引物甚至PCR循环数的差异都会对结果有所影响。因而建议同一项目不同样品的都采用相同的条件和测序方法，这样相互之间才存在可比性。
2.3测序：完成PCR之后的产物一般可以直接上测序仪测序，在上机测序前我们需要对所有样本进行定量和均一化，通常要进行荧光定量PCR。完成定量的样品混合后就可以上机测序。（16S rDNA测序目前可以采用多种不同的测序仪进行测序，包括罗氏的454，Illumina的Novoseq, MiSeq，Hiseq，Life的 PGM 或 Pacbio 以及 nanopore 的三代测序仪。不同的仪器各有优缺点，目前最主流的是Illumina公司的MiSeq，因为其在通量、长度和价格三者之间最为平衡。MiSeq 测序仪可以产生 2x300 bp 的测序读长， Hiseq 和 Novoseq 可以生成 2x250bp 或者 2x150bp 的测序读长，且通量较大。）
3.方法：
16S rDNA分析基本流程：数据预处理；OTU分析；样本差异分析
3.1原始数据处理：
原始测序数据需要去除接头序列，根据 overlap 软件并将双端测序序列进行拼接成单条序列，同时对序列质量进行质控和过滤。提供已知数据库 GreenGenes 作为参考，去除嵌合体序列得到最终可用的序列。
提取出的数据以 fastq 格式保存，每个样本有 fq1 和 fq2两个文件，里面为测序两端的 reads，序列按顺序一一对应。
原始fastq格式是一个文本格式用于存储生物序列（通常是核酸序列）和其测序对应的质量值。这些序列以及质量信息用ASCII字符标识。
3.2OTU分类和统计：
OTU(operational taxonomic units) 是在系统发生学研究或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元（品系，种，属，分组等）设置的同一标志。通常按照 97% 的相似性阈值将序列划分为不同的 OTU，每一个 OTU 通常被视为一个微生物物种。相似性小于97%就可以认为属于不同的种，相似性小于93%-95%，可以认为属于不同的属。样品中的微生物多样性和不同微生物的丰度都是基于对OTU的分析。
使用QIIME（version 1.8.0）工具包进行统计注释。
使用QIIME（version 1.9.0, http://bio.cug.edu.cn/qiime/）的ucluster方法根据97%的序列相似度将所有序列进行同源比对并聚类成operational taxonomic units (OTUs)。然后与数据库GreenGenes（version gg_13_8, http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/JD_Tutorial/nph-16S.cgi）进行比对，比对方法uclust，identity 0.9 。
然后对每个OTUs进行reads数目统计。
下面的2个表，其中一个表是对每个样本的测序数量和OTU数目进行统计，并且在表栺中列出了测序覆盖的完整度（显示前10个样本）。
另一个表是对每个样本在分类字水平上的数量进行统计，并且在表栺中列出了在每个分类字水平上的物种数目（显示前10个样本）。
可以看到绝大部分的OTU都分类到了属（Genus），也有很多分类到了种（Species）。但是仍然有很多无法完全分类到种一级，这是由于环境微生物本身存在非常丰富的多样性，还有大量的菌仍然没有被测序和发现。
测序数目统计表主要是对每个样本的测序数量和OTU数目进行统计，并且在表格中列出了测序覆盖的完整度（显示前10个样本，如果样本超过10个，请查看结果中otu_stat.txt文件）
其中 SampleName表示样本名称；SampleSize表示样本序列总数；OTUsNumber表示注释上的OTU数目；OTUsSeq表示注释上OTU的样本序列总数。
Coverage是指各样品文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低。该指数实际反映了本次测序结果是否代表样本的真实情况。
计算公式为：C=1-n1/N 其中n1 = 只含有一条序列的OTU的数目； N = 抽样中出现的总的序列数目。
分类水平统计表主要是对每个样本在分类学水平上的数量进行统计，并且在表格中列出了在每个分类学水平上的物种数目（只显示前10个样本，如果样本超过10个，请查看结果中taxon_all.txt文件）
其中SampleName表示样本名称；Phylum表示分类到门的OTU数量；Class表示分类到纲的OTU数量；Order表示分类到目的OTU数量；Family表示分类到科的OTU数量；Genus表示分类到属的OTU数量；Species表示分类到种的OTU数量。
