1，Fastq数据质控
2,Fastq转化成bam，包含头文件
bwa aln ref.fa test_1.fq > test_1.sai bwa aln ref.fa test_2.fq > test_2.sai bwa sampe ref.fa -r "@RG ID:<ID> LB:<LIBRARY_NAME> SM:<SAMPLE_NAME> PL:ILLUMINA" test_1.sai test_2.sai test_1.fq test_2.fq > test.sam
3,sam 转化成bam，如果SAM文件中有header @SQ lines。
samtools view -b -S test.sam > test.bam
##如果没有header时： samtools faidx ref.fa
## samtools view -bt ref.fa.fai test.sam > test.bam
4,sort bam
samtools sort test.bam > test.sorted.bam
或者：
java -jar picard.jar SortSam I=test.bam O=test.sorted.bam SORT_ORDER=coordinate
5, 标记重复
java -jar picard.jar MarkDuplicate ....
6, index 一下
samtools index test.sorted.repeatmark.bam
7,Base Quality Score Recalibration
....
8, 使用GATK检测SNP
java -jar GenomeAnalysisTK.jar glm SNP -R ref.fa -T UnifiedGenotyper -I test.sorted.repeatmark.bam -o test.raw.vcf
使用samtools和bcftools检测SNP
samtools faidx ref.fa
samtools mpileup -d 1000 -DSugf test.sorted.repeatmark.bam > test.raw.vcf ##（samtools mpileup -vf 。。。） bcftools view -Nvcg -d 1000 test.raw.vcf > test.snp.vcf ##(我的软件运行这步会出错,用下面两行代码代替)
bcftools call -mv test.raw.vcf > test.raw_varient.vcf
bcftools filter -s LowQual -e '%QUAL<20 || DP>100' test.raw_varient.vcf > test.filt_varient.vcf
##也有直接用perl 脚本实现。在使用bcftools 得到variant calling变异后的结果后。需要对结果再次进行过滤，主要依据对比结果中的第8列消息，其中的DP4最为重要，对应的提供了四列：1, 比对结果和正链一致的reads数；2, 比对结果和负链一致的reads数；3, 比对结果在正链的variant 上的reads数；4, 比对结果在负链的variant上的reads数。当设定（value3+value4）大于某一阈值，才算是variant。
bcftools检测生成的vcf格式有10列。1，参考序列名。2，variant所在的left-most位置。3，variant的ID，（默认未设置，用“.”表示）。4，参考序列的allele。5，variant的allele（有多个alleles，则用“，”分隔）。6,variant/reference Quality。7，FILTers applied。8，varient的信息，使用分号隔开。9，Format of the genotype fields， seperated by colon （optional）。10，Sample genotypes and per-sample information（optional）。
bcftools 的第8列中显示了对variants的信息描述，其中Tag的描述如下：
Tad Format Description
AF1 double Max-likelihood estimate of the site allele Frequency （AF）of the first ALT allele
DP int Raw read depth (without quality filtering)
DP4 int[4] high-quality reference forward base, ref reverse, alternate for and alt rev bases
FQ int consensus quality. Positive: sample genotypes different; negative: otherwise
MQ int Root-Mean-Square mapping quality of covering reads PC2 int[2] Phred probability of AF in group1 samples being larger (,smaller) than in group2 PCHI2 double Posterior weighted chi^2 P-value between group1 and group2 samples PV4 double[4] P-value for strand bias, baseQ bias, mapQ bias and tail distance bias QCHI2 int Phred-scaled PCHI2 RP int # permutations yielding a smaller PCHI2 CLR int Phred log ratio of genotype likelihoods with and without the trio/pair constraint UGT string Most probable genotype configuration without the trio constraint CGT string Most probable configuration with the trio constraint
使用bcftools过滤掉不可靠的位点：
bcftools filter的参数：
-e -exclude 主要用于表达式方式去除匹配上的位点，这个参数很关键，过滤需要此表达式
-g -SnpGap 过滤INDEL附近的snp位点，比如-SnpGap 5 则过滤INDEL附近5个碱基距离内的SNP
-G -IndelGap 过滤INDEL附近的INDEL位点
-o -output 输出文件的名称
-O -output-type 输出的格式，一般z和v都行
-s -soft-filter 将过滤掉的位点用字符串注释
-S -set-GTs setgenotypes of failed samples to missing value (.) or reference allele (0) （将不符合要求的个体基因改为"."）
eg:过滤QUAL小于10，DP值小于5，INDEL附近的位点
bcftools filter -O v -o test.filter_variant.vcf -s LOWQUAL -e 'QUAL<10 || FMT/DP < 5' --SnpGap 5 --set-GTs . test.vcf.gz
提取过滤后的SNP位点
bcftools view -v snps test.filter_variance.vcf > test.snp_filter.vcf
或者在vcf文件中的INFO列里，如果是INDEL的话，会标注出INDEL，因此提取SNP也可以：
grep -v 'INDEL' test.filter_variance.vcf > test.snp_filter.vcf
注意：
|| 与 | 区别：都表示“或”运算， 但是 || 运算符第一个表达式成立的话，后面的表达式不运算，直接返回。而 | 对所有表达式都判断。 && 与 & 的区别同理
参考：https://www.cnblogs.com/xiaofeiIDO/p/6857745.html
http://www.bioinfo-scrounger.com/archives/248