Strand Specific mRNA sequencing 之重要性与分析

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研究生物基因转录体的方法有许多种，而使用次代定序仪系统进行转录体定序是目前相当热门的一种方式，科学家们使用 RNA-seq 分析转录体表现主要期望能够获得三种重要信息：

1. 了解整个转录体构造、splicing 位置以及批注基因的功能。

2. 将所有转录体的表现量多寡定量。

3. 找出 alternative splicing 的可能性方式。

相较于使用转录体反应 DNA-RNA 杂合为基础的 RNA microarray，可以直接地得知转录体的方向性，但目前 RNA-seq 所常用的制备方法必须反转录成 cDNA，因此缺少了转录体序列的方向性，而分析上针对这个问题所作的解决方式为，例如：利用转译的蛋白质基因预测 open reading frame、利用 3’端定序量常较 5’端多的 bias、以及藉由真核生物 splicing 位置方向来做判断。但即使如此，发展能区分出方向性的 RNA-seq 制备方式是很重要的，这是因为当面对较小基因体的物种，如微生物或低等真核生物时，基因会密集的出现在 DNA 的正负股上，而无法确认方向性会造成评估基因表现量上的误判，另外，当转录体表现时，也有机会产生负股调控基因的转录体，这些转录体并不转译，但与蛋白质表现量却息息相关。

目前被用来制备 strand-specific RNA-seq library 的方式五花八门，容易会让操作者困惑不知该选用何种方法为佳，因此 2010 年 9 月 Levin 等人于 Nature Methods 上发表了一篇文章统整了这些制备方式，笔者使用同一来源的 RNA 作为材料，用不同的制备方式制造 cDNA library，尔后使用 illumina 定序系统获得序列数据再分析，而评断这些制备方式孰优孰劣的标准在于：

1. Library complexity-这些 reads 的独特性高低、

2. Strand specificity-将 reads mapping 到已知方向性的 transcripts 上观察方向正确性

3. Eveness and continuity of coverage at annotated transcripts-观察 reads 们在基因上的 coverage 是否够平均分布

4. Performance at 5’ and 3’ ends, defined as agreement with known end annotation-将reads mapping 到已知方向性transcripts 上观察 5’、3’ end 的表现。

图 a.

图 b.

笔者将不同制备方式所呈现出的结果以统计的方式做分析，最后得到的结论为：在 cDNA second strand 合成时导入 dUTP，尔后再于 library 完成后裂解掉带有 dUTP 的那股以获得具方向性 library 的方法为最好的方式，统计上在 library complexity 方面 (图 a)，可以看到 dUTP 在 SE 以及 PE 部份都有 42％、84％的高复杂度，甚至与 control 差不多，而在 strand specific 方向正确性方面 (图 b-gray bar)，包括了 dUTP method共有四种制备方式在此都表现得不错，大约只有 0.47-0.63％转录自负股，与已知的 genes annotation 是吻合的。再来，在序列 Evenness 与 continuity of coverage 方面 (图 b-blue bar)，使用 dUTP method 占第二名 (0.76)。

图 c.

图 d.

最后，在 5’、3’ end performance 上 (图 c)，使用 dUTP method 在基因两端的 reads 数上覆盖率为 62％与73％。将 dUTP method 制备出的 library 与 control library 做比较后 (图 d.) 发现，两者呈现高度的相关性，也因此根据以上统计后的数值，以及制备流程的方便性，dUTP method 是在制备 strand-specific mRNA library上比较合适的方式。

参考文献：

Levin JZ, Yassour M, Adiconis X, Nusbaum C, Thompson DA, et al. (2010) Comprehensive comparative analysis of strand-specific RNA sequencing methods. Nat Methods 7: 709-715.