ChIP-seq | ATAC-seq | RNA-seq | 数据分析流程

补充RNA-seq流程

以前都是自己搭RNA-seq流程，虽然可以完成任务，但是数据量一多，批次多起来，就非常难管理。

既然别人提供了这么好的流程，那就要用起来，管理起来不是一般的轻松。

ENCODE-DCC/rna-seq-pipeline

安装比较麻烦，没有针对local的一键安装，但我们可以借鉴Dockerfile文件里面的安装方法。

也可以模仿chip-seq-pipeline2/scripts/install_conda_env.sh的安装方法。

conda install -c anaconda ncurses
conda install -c r r-base
conda install -c conda-forge ghostscript

conda install -c anaconda zlib
conda install -c anaconda xz

conda install samtools==1.9
conda install -c bioconda star
conda install -c bioconda kallisto
conda install -c bioconda rsem

pip install pandas==0.24.2
pip install pysam==0.15.3
pip install qc-utils==19.8.1

mkdir manual_install_tools && cd manual_install_tools

#wget http://zlib.net/zlib-1.2.11.tar.gz && tar -xvf zlib-1.2.11.tar.gz
#cd zlib-1.2.11 && ./configure --prefix /home/lizhixin/softwares/rna-seq-pipeline/manual_install_tools/zlib-1.2.11 && make && make install && rm ../zlib-1.2.11.tar.gz

#wget https://tukaani.org/xz/xz-5.2.3.tar.gz && tar -xvf xz-5.2.3.tar.gz
#cd xz-5.2.3 && ./configure && make && make install && rm ../xz-5.2.3.tar.gz

#wget https://github.com/alexdobin/STAR/archive/2.5.1b.tar.gz && tar -xzf 2.5.1b.tar.gz
#cd STAR-2.5.1b && make STAR && rm ../2.5.1b.tar.gz

# wget https://github.com/pachterlab/kallisto/releases/download/v0.44.0/kallisto_linux-v0.44.0.tar.gz && tar -xzf kallisto_linux-v0.44.0.tar.gz

#git clone --branch 1.9 --single-branch https://github.com/samtools/samtools.git && 
        #    git clone -b 1.9 --single-branch git://github.com/samtools/htslib.git && 
        #    cd samtools && make && make install && cd ../ && rm -rf samtools* htslib*

#wget https://github.com/deweylab/RSEM/archive/v1.2.31.zip
# unzip v1.2.31.zip && rm v1.2.31.zip
# cd RSEM-1.2.31 && make

git clone https://github.com/ENCODE-DCC/kentutils_v385_bin_bulkrna.git

　　

已经测试成功，等待大数据的考验。   

还需要下载REFERENCE。

kallisto index -i kallisto.hg19.self.build.idx Homo_sapiens.GRCh37.cdna.all.fa.gz

　　

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2020年05月22日

需要再把iPSC的数据跑完

发现每一个pipeline都需要准备一个独立的conda环境，看到下面的安装前的卸载命令了吗！！！

安装也需要一定的资源，需要登录计算节点。

$ bash scripts/uninstall_conda_env.sh  # uninstall it for clean-install
$ bash scripts/install_conda_env.sh

在这之前需要：

https://github.com/ENCODE-DCC/atac-seq-pipeline/blob/master/docs/install_conda.md

准备一个单独的文件夹，装一下conda；

conda config --set auto_activate_base false

conda activate encode-atac-seq-pipeline

注意：GitHub上下载的pipeline需要做部分修改，细节参照下面。

现在管理程序需要消耗3个以上的core，所以需要投递到稍微大一点的节点！

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思来想去，还是觉得ENCODE的流程靠谱，所以又花了快一周来调试，终于排除万难，跑成功了。【2019年12月08日】

以下是ATAC生成的结果目录：

call-align         call-call_peak_pooled  call-filter           call-idr_ppr                    call-overlap      call-pool_ta_pr2              call-spr
call-align_mito    call-call_peak_ppr1    call-frac_mito        call-idr_pr                     call-overlap_ppr  call-qc_report                call-tss_enrich
call-annot_enrich  call-call_peak_ppr2    call-fraglen_stat_pe  call-jsd                        call-overlap_pr   call-read_genome_tsv          metadata.json
call-bam2ta        call-call_peak_pr1     call-gc_bias          call-macs2_signal_track         call-pool_ta      call-reproducibility_idr
call-call_peak     call-call_peak_pr2     call-idr              call-macs2_signal_track_pooled  call-pool_ta_pr1  call-reproducibility_overlap

　　

马上测试ChIP-seq：

报错：

Error: package or namespace load failed for ‘caTools’:
 package ‘caTools’ was installed by an R version with different internals; it needs to be reinstalled for use with this R version
Error: package ‘caTools’ could not be loaded

用这个conda装了R3.6.1，装了几个包，可能把原来的包给覆盖了，只能重新装一个这个pipeline了，以后自己的包就不要装在默认的conda的目录里了。

必须为这两个流程准备独立的conda，不要用conda装任何R和python的包。

ChIP-seq也终于跑成功了：

call-align               call-call_peak_ppr2  call-idr_ppr                    call-pool_ta_pr1
call-align_ctl           call-call_peak_pr1   call-jsd                        call-pool_ta_pr2
call-align_R1            call-call_peak_pr2   call-macs2_signal_track         call-qc_report
call-bam2ta              call-choose_ctl      call-macs2_signal_track_pooled  call-read_genome_tsv
call-bam2ta_ctl          call-filter          call-overlap                    call-reproducibility_overlap
call-bam2ta_no_dedup_R1  call-filter_ctl      call-overlap_ppr                call-spr
call-call_peak           call-filter_R1       call-overlap_pr                 call-xcor
call-call_peak_pooled    call-fraglen_mean    call-pool_ta                    metadata.json
call-call_peak_ppr1      call-gc_bias         call-pool_ta_ctl

　　

核心几点：

1. 用新的conda，以前所有的conda环境都要移除，~/.bash_profile，特别是R相关的

export R_LIBS_USER=/home/-/softwares/R_lib3
export R_LIBS=/home/-/softwares/R_lib3

2. 源码里面有两个文件的grep -P要改为grep -E

3. wdl文件里的默认资源设置要改，否则会溢出　　

质量控制QC：

Quality control in ChIP-seq data Using the ChIPQC package 

ChIP-seq Data quality and Analysis Pipeline - 刘小乐大佬，Cistrome project

ChiLin: a comprehensive ChIP-seq and DNase-seq quality control and analysis pipeline

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参考链接：

一篇文章学会ChIP-seq分析（上）

一篇文章学会ChIP-seq分析（下）

第10篇：ATAC-Seq、ChIP-Seq、RNA-Seq整合分析（本系列完结，内附目录）

基本步骤

1. 用FastQC进行质控检测
2. 用Trimmomatic进行质量过滤
3. 用Bowtie2比对
4. 用MACS2 call peaks

H3K27Ac + H3K4Me1 = Active enhancers
H3K27Ac + H3K4Me3 = Active promoters
H3K4Me1 - H3K27Ac = Inactive/Poised enhancers.

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ENCODE已经有非常成熟的pipeline了，会用就行了。【已测试，均可运行，非常高效】

ENCODE-DCC

• atac-seq-pipeline
• chip-seq-pipeline2

关于整个流程，也有非常详细的介绍。

ChIP-seq Data Standards and Processing Pipeline

ATAC-seq Data Standards and Prototype Processing Pipeline

还有比这更靠谱的pipeline吗，肯定是没了。但是开始学习时肯定不推荐用这些pipeline，封装得太好了，完全学不到什么精华知识。

安装完成后，建议自己构建小测试数据来测试流程，我测试了没问题。

这些流程的NB之处：

• 分析随时能够续上，Resume pipeline，除非你有HPC的root权限；
• 良好的组织形式，报告，结果文件，能看懂结果就好
• 考虑得非常细，每一个细节，这就是ENCODE大型项目的态度（这就是为什么不推荐自己分析，这么多细节，搞透最少要一个月） 

缺点也非常明显：新手无法掌控这些流程

折腾了几天后的感想：

1. 这个流程设计得太复杂了，什么平台都想囊括在内，导致什么平台都没有真正做好；

2. 最核心的工具部署测试环节没了，导致软件的部署调试非常难，表面上看是部署成功了，但是可能跑了一天就报错终止了；

3. 流程恢复非常不智能，一个小报错就足以让你一天白跑；

4. 流程交互性不够，需要一个最基本的统计，整个流程跑了多少，多少成功，多少失败，最好有一个任务监控的报告monitor；

5. 这些流程设计之初就是为了ENCODE项目，只要能在他们机器上部署成功，能批量运行就行；后面又想服务大众，可兼容性没那么简单，每个机器本地环境不同，标准化部署很难；

看了GitHub的issue，才发现大家都有一样的问题，这个pipeline的根本还是顶层设计有问题，累死开发者，气死使用者

如果我是领导，我会这样拯救这个项目：

1. 独立出所有的云平台pipeline，因为云平台的配置部署简单稳定，不存在疑难杂症（问题是大部分实验室根本就没有普及云平台，用不到）；

2. 单独做一份针对本地的PBS和SGE用户的原始脚本pipeline，这部分就是GitHub上面大家普遍抱怨的部分，这部分责任本来就不属于流程开发者，我就给你提供一个大框架，软件安装测试你们自己去做，不要把这部分责任揽到自己头上，吃力不讨好；

不要什么都想要，又什么都没做好；具体问题具体分析，适应形势，所有的一刀切最终都是悲剧。

另外提一下，流程部署最重要的就是稳定性，特别是同一批数据，绝对不能用不同的流程，甚至是软件版本、参数都不能变，否则这些数据之间就没有了可比性，一个实验室一旦搭建好了分析流程，一般都要用10年。

必须要手动修改这个流程了，否则只有放弃。

环境报错【错误的定位到了以前的conda里】：

from pysam.libchtslib import *
from matplotlib import pyplot as plt

ModuleNotFoundError: No module named 'matplotlib'
ImportError: libhts.so.1: cannot open shared object file: No such file or directory　　

把conda重新安装一下，以前的conda全部清理掉，留下这个sandbox的conda

qsub: would exceed queue's generic per-user limit

队列的问题，It is possible that you tried submitting the job to a queue that has a max_queued limit—a specified maximum number of jobs that each user can submit to a queue (running or waiting)—and you have already reached that limit.

source activate encode-chip-seq-pipeline

json配置文件里的内存不要瞎设置，picard就保持默认就行，因为它默认只给8G。 

不要build genome了，直接下载，chip和ATAC都一样

bash scripts/download_genome_data.sh hg19 ~/softwares/chip-seq-pipeline2/db　　

经查看，两个的基因组是一模一样的，不必重复下载，用同一个数据库，test数据可以顺利跑完。

diff scripts/download_genome_data.sh ../atac-seq-pipeline/scripts/download_genome_data.sh

　

用测试数据跑有个问题，数据太小没有结果，导致后面跑不下去，并不是流程有什么问题。

比如以下这些file在小数据集中是不会生成的。

bfilt.frip.qc

bfilt.narrowPeak.bb

bfilt.narrowPeak.hammock.gz 

就会报错：

ln: failed to access ‘/home/-/project2/analysis/ATAC-seq/encode-pipeline/encc/subsample/result/atac/a1db1b2f-64b6-4bce-b51b-2d5ee2d316bb/call-idr_ppr/execution/*.bfilt.narrowPeak.bb’: No such file or directory
ln: failed to access ‘/home/-/project2/analysis/ATAC-seq/encode-pipeline/encc/subsample/result/atac/a1db1b2f-64b6-4bce-b51b-2d5ee2d316bb/call-idr_ppr/execution/*.bfilt.narrowPeak.hammock.gz*’: No such file or directory
mkdir: cannot create directory ‘/home/-/project2/analysis/ATAC-seq/encode-pipeline/encc/subsample/result/atac/a1db1b2f-64b6-4bce-b51b-2d5ee2d316bb/call-idr_ppr/execution/glob-08ed81b9c4c9ccf6c3692d9ea29b11e0’: File exists
ln: failed to access ‘/home/-/project2/analysis/ATAC-seq/encode-pipeline/encc/subsample/result/atac/a1db1b2f-64b6-4bce-b51b-2d5ee2d316bb/call-idr_ppr/execution/*.bfilt.narrowPeak.hammock.gz*’: No such file or directory
ln: failed to access ‘/home/-/project2/analysis/ATAC-seq/encode-pipeline/encc/subsample/result/atac/a1db1b2f-64b6-4bce-b51b-2d5ee2d316bb/call-idr_ppr/execution/*.frip.qc’: No such file or directory

　　

如果不是在云服务器或者有root权限，就无法使用数据库来存储任务进度，失败的任务只能重头再来，没法恢复。

所以对于那些没有root权限，在HPC上跑的人来说，提前的部署测试至关重要，不要直接上大数据开跑。

报错：=>> PBS: job killed: ncpus 2.35 exceeded limit 1 (sum)

不是所有的任务都可以在json里定义资源的实用，最本质的资源定义在流程的atac.wdl文件里。

因为我是统一队列，所以CPU和MEM可以统一，cpu=10，mem=40000

这个需要针对自己的集群设置一下。

好好分析一下，为什么--db file 这种形式的数据库无法恢复任务，为什么不稳定？

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Linux安装问题：

grep: this version of PCRE is compiled without UTF support

grep -P 改为 grep -E就可以解决了，参考链接。【这种方法没有解决根本问题，流程里还有其他代码】

所以最根本的就是直接更新PCRE：【安装也解决不了问题，所以还是每一个grep改一下吧，改两处就行】

创建一个grep.test.sh测试grep是否正常工作：

conda env list | grep -E "atac-seq-pipelines"　　

 其次安装pcre

source activate encode-chip-seq-pipeline
conda install -c anaconda pcre
conda deactivate

source activate encode-atac-seq-pipeline
conda install -c anaconda pcre
conda deactivate

　　

老版的conda用source activate，新版的用conda activate

source activate encode-chip-seq-pipeline
source activate encode-atac-seq-pipeline
source deactivate
conda deactivate

　　

　　

ChIP-seq的control问题：

Guide: Getting Started with ChIP-Seq

省钱了，以后chip-seq不用做control了！用机器学习替代ChIP-seq中的control　

suinleelab/AIControl.jl

ChIP-seq 分析原理

ChIP-seq阴阳-正负对照

ATAC-seq（都要用绝对路径，不然找不到文件；还需要指定输出目录，不然默认会输出到home目录）

echo "caper run ~/softwares/atac-seq-pipeline/atac.wdl -i ~/project2/ATAC-seq/ENCC/test.full.json --out-dir ~/project2/ATAC-seq/ENCC/result" | qsub -V -N ATAC -q large -l nodes=1:ppn=12,walltime=84:00:00,mem=120gb

关于平台的选择：

这些pipeline适配了超级多的平台，各种云平台，服务器，本地机。

对于普通用户肯定是在本地、PBS或SGE上跑。

• 本地跑：需要非常多的核心，我12个核都跑不起来，所以看来最少要20个核。
• PBS：还好我也有PBS集群，设置好queue即可并行，非常简单。

　　

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ChIP-seq练习数据

download.list

ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP017/SRP017311/SRR620204/SRR620204.sra
ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP017/SRP017311/SRR620205/SRR620205.sra
ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP017/SRP017311/SRR620206/SRR620206.sra
ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP017/SRP017311/SRR620207/SRR620207.sra
ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP017/SRP017311/SRR620208/SRR620208.sra
ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP017/SRP017311/SRR620209/SRR620209.sra

fastq-dump

ls *sra |while read id; do ~/biosoft/sratoolkit/sratoolkit.2.6.3-centos_linux64/bin/fastq-dump –split-3 $id;done

Please find attached two sets of ENCC enhancers. Basically,

• "encc-enhancer.bed" is enhancers defined with H3K27ac & H3K4me1 activity
• "encc-enhancer-atac.bed" is enhancers defined with H3K27ac & H3K4me1 activity as well as open chromatin (ATAC-seq) signal summits.

The procedure to produce these files is as follow:

1. Process ATAC-seq and ChIP-seq data using standard ENCODE pipeline (https://github.com/ENCODE-DCC/chip-seq-pipeline https://github.com/kundajelab/atac_dnase_pipelines) => Get narrowpeaks for ATAC-seq and ChIP-seq
2. Following http://compbio.mit.edu/ChromHMM/ChromHMM_manual.pdf, binarized the peak files and run ChromHMM on histone marks and ATAC-seq
3. Examine the resulting emission probability matrix (see emission.png), found that segment types E2 and E3 are more like enhancers (accessible or not)
4. Extract E2+E3 as encc-enhancer.bed
5. To get enhancer with unified length, further overlap encc-enhaner.bed with ATAC-seq summit (summit is the base with the highest level in a peak) and use +/-500 bp around the ATAC-seq summit as enhancers. => encc-enhancer-atac.bed