Heatmap

我们在分析了差异表达数据之后，经常要生成一种直观图－－热图(heatmap)。这一节就以基因芯片数据为例，示例生成高品质的热图。

比如

钢蓝渐白配色的热图

首先还是从最简单的heatmap开始。

> library(ggplot2)
> library(ALL) #可以使用biocLite("ALL")安装该数据包
> data("ALL")
> library(limma)
> eset<-ALL[,ALL$mol.biol %in% c("BCR/ABL","ALL1/AF4")]
> f<-factor(as.character(eset$mol.biol))
> design<-model.matrix(~f)
> fit<-eBayes(lmFit(eset,design)) #对基因芯片数据进行分析，得到差异表达的数据
> selected  <- p.adjust(fit$p.value[, 2]) <0.001 
> esetSel <- eset[selected,] #选择其中一部分绘制热图
> dim(esetSel) #从这尺度上看，数目并不多，但也不少。如果基因数过多，可以分两次做图。
Features  Samples 
      84       47 
> library(hgu95av2.db)
> data<-exprs(esetSel)
> probes<-rownames(data)
> symbol<-mget(probes,hgu95av2SYMBOL,ifnotfound=NA)
> symbol<-do.call(rbind,symbol)
> symbol[is.na(symbol[,1]),1]<-rownames(symbol)[is.na(symbol[,1])]
> rownames(data)<-symbol[probes,1] #给每行以基因名替换探针名命名，在绘制热图时直接显示基因名。
> heatmap(data,cexRow=0.5)

使用heatmap函数默认颜色生成的热图

这个图有三个部分，样品分枝树图和基因分枝树图，以及热图本身。之所以对样品进行聚类分析排序，是因为这次的样品本身并没有分组。如果有分组的话，那么可以关闭对样品的聚类分析。对基因进行聚类分析排序，主要是为了色块好看，其实可以选择不排序，或者使用GO聚类分析排序。上面的这种热图，方便简单，效果非常不错。

接下来我们假设样品是分好组的，那么我们想用不同的颜色来把样品组标记出来，那么我们可以使用ColSideColors参数来实现。同时，我们希望变更热图的渐变填充色，可以使用col参数来实现。

> color.map <- function(mol.biol) { if (mol.biol=="ALL1/AF4") "#FF0000" else "#0000FF" }
> patientcolors <- unlist(lapply(esetSel$mol.bio, color.map))
> heatmap(data, col=topo.colors(100), ColSideColors=patientcolors, cexRow=0.5)

使用heatmap函数top.colors填充生成的热图

在heatmap函数中，样品分组只能有一种，如果样品分组有多次分组怎么办？heatmap.plus就是来解决这个问题的。它们的参数都一致，除了ColSideColors和RowSideColors。heatmap使用是一维数组，而heatmap.plus使用的是字符矩阵来设置这两个参数。

> library(heatmap.plus)
> hc<-hclust(dist(t(data)))
> dd.col<-as.dendrogram(hc)
> groups <- cutree(hc,k=5)
> color.map <- function(mol.biol) { if (mol.biol=="ALL1/AF4") 1 else 2 }
> patientcolors <- unlist(lapply(esetSel$mol.bio, color.map))
> col.patientcol<-rbind(groups,patientcolors)
> mode(col.patientcol)<-"character"
> heatmap.plus(data,ColSideColors=t(col.patientcol),cexRow=0.5)

使用heatmap.plus绘制热图

这样绘图的不足是没有热图色key值。gplots中的heatmap.2为我们解决了这个问题。而且它带来了更多的预设填充色。下面就是几个例子。

> library("gplots")
> heatmap.2(data, col=redgreen(75), scale="row", ColSideColors=patientcolors,
+            key=TRUE, symkey=FALSE, density.info="none", trace="none", cexRow=0.5)

使用heatmap.2函数,readgreen渐变色填充生成的热图

> heatmap.2(data, col=heat.colors(100), scale="row", ColSideColors=patientcolors,
+            key=TRUE, symkey=FALSE, density.info="none", trace="none", cexRow=0.5)
> heatmap.2(data, col=terrain.colors(100), scale="row", ColSideColors=patientcolors,
+            key=TRUE, symkey=FALSE, density.info="none", trace="none", cexRow=0.5)
> heatmap.2(data, col=cm.colors(100), scale="row", ColSideColors=patientcolors,
+            key=TRUE, symkey=FALSE, density.info="none", trace="none", cexRow=0.5)
> heatmap.2(data, col=redblue(100), scale="row", ColSideColors=patientcolors,
+            key=TRUE, symkey=FALSE, density.info="none", trace="none", cexRow=0.5)
> heatmap.2(data, col=colorpanel(100,low="white",high="steelblue"), scale="row", ColSideColors=patientcolors,
+            key=TRUE, keysize=1, symkey=FALSE, density.info="none", trace="none", cexRow=0.5)

使用heatmap.2函数,heat.colors渐变色填充生成的热图

使用heatmap.2函数,terrain.colors渐变色填充生成的热图

使用heatmap.2函数,cm.colors渐变色填充生成的热图

使用heatmap.2函数,redblue渐变色填充生成的热图

使用heatmap.2函数,colorpanel渐变色填充生成的热图

然而，以上的heatmap以及heatmap.2虽然方便简单，效果也很不错，可以使用colorpanel方便的设置渐变填充色，但是它的布局没有办法改变，生成的效果图显得有点呆板，不简洁。为此这里介绍如何使用ggplot2当中的geom_tile来为基因芯片绘制理想的热图。

> library(ggplot2)
> hc<-hclust(dist(data))
> rowInd<-hc$order
> hc<-hclust(dist(t(data)))
> colInd<-hc$order
> data.m<-data[rowInd,colInd] #聚类分析的作用是为了色块集中，显示效果好。如果本身就对样品有分组，基因有排序，就可以跳过这一步。
> data.m<-apply(data.m,1,rescale) #以行为基准对数据进行变换，使每一行都变成［0,1］之间的数字。变换的方法可以是scale,rescale等等，按照自己的需要来变换。
> data.m<-t(data.m) #变换以后转置了。
> coln<-colnames(data.m) 
> rown<-rownames(data.m) #保存样品及基因名称。因为geom_tile会对它们按坐标重排，所以需要使用数字把它们的序列固定下来。
> colnames(data.m)<-1:ncol(data.m)
> rownames(data.m)<-1:nrow(data.m)
> data.m<-melt(data.m) #转换数据成适合geom_tile使用的形式
> head(data.m)
  X1 X2     value
1  1  1 0.1898007
2  2  1 0.6627467
3  3  1 0.5417057
4  4  1 0.4877054
5  5  1 0.5096474
6  6  1 0.2626248
> base_size<-12 #设置默认字体大小，依照样品或者基因的多少而微变。
> (p <- ggplot(data.m, aes(X2, X1)) + geom_tile(aes(fill = value), #设定横坐标为以前的列，纵坐标为以前的行，填充色为转换后的数据
+      colour = "white") + scale_fill_gradient(low = "white", #设定渐变色的低值为白色，变值为钢蓝色。
+      high = "steelblue"))
> p + theme_grey(base_size = base_size) + labs(x = "", #设置xlabel及ylabel为空
+      y = "") + scale_x_continuous(expand = c(0, 0),labels=coln,breaks=1:length(coln)) + #设置x坐标扩展部分为0，刻度为之前的样品名
+      scale_y_continuous(expand = c(0, 0),labels=rown,breaks=1:length(rown)) + opts( #设置y坐标扩展部分为0，刻度为之前的基因名
+      axis.ticks = theme_blank(), axis.text.x = theme_text(size = base_size *  #设置坐标字体为基准的0.8倍，贴近坐标对节，x坐标旋转90度，色彩为中灰
+      0.8, angle = 90, hjust = 0, colour = "grey50"), axis.text.y = theme_text(
+      size = base_size * 0.8, hjust=1, colour="grey50"))

使用ggplot2中geom_tile函数,钢蓝渐白配色的热图

也可以很轻松的实现传统渐变填充色，红黄渐变。

> (p <- ggplot(data.m, aes(X2, X1)) + geom_tile(aes(fill = value),
+      colour = "white") + scale_fill_gradient(low = "yellow",
+      high = "red"))
> p + theme_grey(base_size = base_size) + labs(x = "",
+      y = "") + scale_x_continuous(expand = c(0, 0),labels=coln,breaks=1:length(coln)) +
+      scale_y_continuous(expand = c(0, 0),labels=rown,breaks=1:length(rown)) + opts(
+      axis.ticks = theme_blank(), axis.text.x = theme_text(size = base_size *
+      0.8, angle = 90, hjust = 0, colour = "grey50"), axis.text.y = theme_text(
+      size = base_size * 0.8, hjust=1, colour="grey50"))

使用ggplot2中geom_tile函数，红黄渐变填充的热图

使用红绿渐变填充。

> (p <- ggplot(data.m, aes(X2, X1)) + geom_tile(aes(fill = value),
+      colour = "white") + scale_fill_gradient(low = "green",
+      high = "red"))
> p + theme_grey(base_size = base_size) + labs(x = "",
+      y = "") + scale_x_continuous(expand = c(0, 0),labels=coln,breaks=1:length(coln)) +
+      scale_y_continuous(expand = c(0, 0),labels=rown,breaks=1:length(rown)) + opts(
+      axis.ticks = theme_blank(), axis.text.x = theme_text(size = base_size *
+      0.8, angle = 90, hjust = 0, colour = "grey50"), axis.text.y = theme_text(
+      size = base_size * 0.8, hjust=1, colour="grey50"))

使用ggplot2中geom_tile函数，红绿渐变填充的热图

使用绿白渐变填充。

> (p <- ggplot(data.m, aes(X2, X1)) + geom_tile(aes(fill = value),
+      colour = "white") + scale_fill_gradient(low = "seagreen",
+      high = "white"))
> p + theme_grey(base_size = base_size) + labs(x = "",
+      y = "") + scale_x_continuous(expand = c(0, 0),labels=coln,breaks=1:length(coln)) +
+      scale_y_continuous(expand = c(0, 0),labels=rown,breaks=1:length(rown)) + opts(
+      axis.ticks = theme_blank(), axis.text.x = theme_text(size = base_size *
+      0.8, angle = 90, hjust = 0, colour = "grey50"), axis.text.y = theme_text(
+      size = base_size * 0.8, hjust=1, colour="grey50"))

使用ggplot2中geom_tile函数，绿白渐变填充的热图

使用棕白渐变填充。

> (p <- ggplot(data.m, aes(X2, X1)) + geom_tile(aes(fill = value),
+      colour = "white") + scale_fill_gradient(low = "white",
+      high = "sienna4"))
> p + theme_grey(base_size = base_size) + labs(x = "",
+      y = "") + scale_x_continuous(expand = c(0, 0),labels=coln,breaks=1:length(coln)) +
+      scale_y_continuous(expand = c(0, 0),labels=rown,breaks=1:length(rown)) + opts(
+      axis.ticks = theme_blank(), axis.text.x = theme_text(size = base_size *
+      0.8, angle = 90, hjust = 0, colour = "grey50"), axis.text.y = theme_text(
+      size = base_size * 0.8, hjust=1, colour="grey50"))

使用ggplot2中geom_tile函数，棕白渐变填充的热图

使用灰阶填充。

> (p <- ggplot(data.m, aes(X2, X1)) + geom_tile(aes(fill = value),
+      colour = "white") + scale_fill_gradient(low = "black",
+      high = "gray85"))
> p + theme_grey(base_size = base_size) + labs(x = "",
+      y = "") + scale_x_continuous(expand = c(0, 0),labels=coln,breaks=1:length(coln)) +
+      scale_y_continuous(expand = c(0, 0),labels=rown,breaks=1:length(rown)) + opts(
+      axis.ticks = theme_blank(), axis.text.x = theme_text(size = base_size *
+      0.8, angle = 90, hjust = 0, colour = "grey50"), axis.text.y = theme_text(
+      size = base_size * 0.8, hjust=1, colour="grey50"))

使用ggplot2中geom_tile函数，灰色渐变填充的热图

除了ggplot2，还有lattice也是不错的选择。我只使用一种填充色，生成两个图，以作示例。

> hc<-hclust(dist(data))
> dd.row<-as.dendrogram(hc)
> row.ord<-order.dendrogram(dd.row) #介绍另一种获得排序的办法
> hc<-hclust(dist(t(data)))
> dd.col<-as.dendrogram(hc)
> col.ord<-order.dendrogram(dd.col)
> data.m<-data[row.ord,col.ord]
> library(ggplot2)
> data.m<-apply(data.m,1,rescale) #rescale是ggplot2当中的一个函数
> library(lattice)
> levelplot(data.m,
+           aspect = "fill",xlab="",ylab="",
+           scales = list(x = list(rot = 90, cex=0.8),y=list(cex=0.5)),
+           colorkey = list(space = "left"),col.regions = heat.colors)
> library(latticeExtra)
> levelplot(data.m,
+           aspect = "fill",xlab="",ylab="",
+           scales = list(x = list(rot = 90, cex=0.5),y=list(cex=0.4)),
+           colorkey = list(space = "left"),col.regions = heat.colors,
+           legend =
+           list(right =
+                list(fun = dendrogramGrob, #dendrogramGrob是latticeExtra中绘制树型图的一个函数
+                     args =
+                     list(x = dd.row, ord = row.ord,
+                          side = "right",
+                          size = 5)),
+                top =
+                list(fun = dendrogramGrob,
+                     args =
+                     list(x = dd.col, 
+                          side = "top",
+                          type = "triangle")))) #使用三角型构图

使用lattice中的levelplot函数，heat.colors填充绘制热图

使用lattice中的levelplot函数，heat.colors填充，dendrogramGrob绘树型，绘制热图

可是可是，绘制一个漂亮的热图这么难么？参数如此之多，设置如此复杂，色彩还需要自己指定。有没有简单到发指的函数呢？有！那就是pheatmap，全称pretty heatmaps.

> library(pheatmap)
> pheatmap(data,fontsize=9, fontsize_row=6) #最简单地直接出图
> pheatmap(data, scale = "row", clustering_distance_row = "correlation", fontsize=9, fontsize_row=6) #改变排序算法
> pheatmap(data, color = colorRampPalette(c("navy", "white", "firebrick3"))(50), fontsize=9, fontsize_row=6) #自定义颜色
> pheatmap(data, cluster_row=FALSE, fontsize=9, fontsize_row=6) #关闭按行排序
> pheatmap(data, legend = FALSE, fontsize=9, fontsize_row=6) #关闭图例
> pheatmap(data, cellwidth = 6, cellheight = 5, fontsize=9, fontsize_row=6) #设定格子的尺寸
> color.map <- function(mol.biol) { if (mol.biol=="ALL1/AF4") 1 else 2 }
> patientcolors <- unlist(lapply(esetSel$mol.bio, color.map))
> hc<-hclust(dist(t(data)))
> dd.col<-as.dendrogram(hc)
> groups <- cutree(hc,k=7)
> annotation<-data.frame(Var1=factor(patientcolors,labels=c("class1","class2")),Var2=groups)
> pheatmap(data, annotation=annotation, fontsize=9, fontsize_row=6) #为样品分组
> Var1 = c("navy", "skyblue")
> Var2 = c("snow", "steelblue")
> names(Var1) = c("class1", "class2")
> ann_colors = list(Var1 = Var1, Var2 = Var2)
> pheatmap(data, annotation=annotation, annotation_colors = ann_colors, fontsize=9, fontsize_row=6) #为分组的样品设定颜色

pheatmap最简单地直接出图

pheatmap改变排序算法

pheatmap自定义颜色

pheatmap关闭按行排序

pheatmap关闭图例

pheatmap设定格子的尺寸

pheatmap为样品分组

pheatmap为分组的样品设定颜色